温度与时间对玉米肽美拉德产物风味特性的影响

于静洋， 周 烨， 张晓鸣， 夏书芹

（江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122）

随着食品工业的快速发展和消费者需求的日益提升，如何使食品安全、美味与健康并存已成为食品科学关注的焦点之一。 因此，食品风味特性的增强与改善对现代食品与餐饮业的发展具有重要意义。 基于美拉德反应开发不同风味的调味品核心基料是改善食品风味品质的有效措施。 借助该反应不仅可以通过加热形成各类挥发性风味化合物增强食品的香气，而且也会产生非挥发性的呈味物质如美拉德肽等显著增强食品的鲜味、醇厚味和持续性[1]。 然而，美拉德反应错综复杂，所形成的风味也迥然不同，因此，实现调味品核心基料风味的定向调控对促进食品工业的发展具有指导价值。

相比于氨基酸-还原糖模型体系， 引入肽所构建的美拉德反应体系在多种风味的形成方面更具优势。 考虑到安全性和经济成本的问题，人们逐渐由以动物蛋白肽作为反应原料转向价格低廉、质量稳定的植物蛋白肽[1-2]。 木糖由于其反应活性高且价格低的优势，常作为碳源进行美拉德反应，赋予多肽良好的风味特性；半胱氨酸的添加则有助于提升大豆肽-木糖体系产物的肉香味[3]。 除了体系的基质外， 温度和时间是影响美拉德反应过程的直接因素，其变化会促使反应沿不同途径进行，通过影响中间体的形成速率和积累量，使得产物的风味和滋味产生差异[4-5]。 通常反应速度会随反应温度升高而加快，温度每升高10 ℃，反应速度增加3～5 倍。 但过高的反应温度可能会形成一些潜在的危害因子，因此通常控制在180 ℃以下，以100～150 ℃较为适宜。 目前，部分学者以植物蛋白酶解物为原料，在美拉德反应强化多肽风味方面进行了系列研究。He 等以菜籽肽为原料，与木糖在80～140 ℃、pH 7.4 条件下加热2 h， 制得了不同风味特性的菜籽肽风味增强剂[6]。 玉米蛋白质因其水溶性差、气味特殊限制了其在食品工业中的应用，作者所在课题组前期研究发现玉米肽的美拉德反应产物醇厚味比较突出[7-9]。但迄今为止，以玉米蛋白质为原料，通过美拉德反应调控兼具肉香味和醇厚味的美拉德反应产物的研究还未见报道。

作者基于玉米肽-木糖-半胱氨酸体系，重点考察了反应温度和时间对其美拉德反应产物风味特性的调控作用；以相对分子质量分布、游离氨基酸组成以及挥发性化合物为指标，考察了反应条件对美拉德反应产物化学组成的影响。 在此基础上，基于偏最小二乘回归对美拉德反应产物风味成分和感官特性之间的相关性进行分析，明确影响各感官指标的相关贡献成分，为不同风味特性玉米肽美拉德反应产物的定向制备奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米蛋白质、复合蛋白酶：安徽强旺调味食品有限公司产品；木糖、半胱氨酸（均为食品级）：上海源叶生物科技有限公司产品；三氯乙酸、乙腈、甲醇等（均为色谱级）：国药集团化学试剂有限公司产品；C6～C24 的正构烷烃标准品：Sigma 试剂公司产品。

1.2 仪器与设备

DF-101SZ 型集热式磁力加热搅拌器：科瑞仪器有限公司产品；5810R 型冷冻离心机：德国Eppendorf 公司产品；KDN-103F 型自动定氮仪：上海纤检仪器有限公司产品；TSQ 气质联用仪：美国赛默飞世尔科技公司产品；Waters 1525EF 高效液相色谱仪：美国沃特世公司产品；安捷伦1100 氨基酸自动分析仪：美国安捷伦公司产品。

1.3 研究方法

1.3.1 美拉德反应产物的制备 称取适量玉米蛋白粉，加去离子水配成质量分数为10%的分散悬浮液。 于58 ℃、pH 8 条件下采用3000 U/g 的复合蛋白酶酶解3 h，灭酶10 min 后迅速冷却。4000 r/min冷却离心20 min，取上清液得到玉米肽[9]。 按照一定比例称取玉米肽、木糖和半胱氨酸，混合均匀后调节pH 至7.4， 在不同温度下反应120 min， 或者在120 ℃下反应不同时间，迅速冷却终止反应，得到玉米肽-木糖-半胱氨酸美拉德反应产物[10]。

1.3.2 美拉德反应产物的感官评定 按照美拉德反应产物质量分数0.1%和食盐质量分数0.5%的比例配制待测溶液，等量食盐水为空白对照，所有样品于60 ℃水浴中保温。 邀请15 位经验丰富的感官评定员，对样品的醇厚味、肉香味、焦香味、持续性、整体可接受性和异味6 项指标进行打分（0～7 分），分值越高效果越强。 重复3 次取平均值计算最终得分[11]。

1.3.3 相对分子质量分布的测定 称取100 mg 样品于10 mL 容量瓶中，流动相定容，于10000 r/min离心15 min，微孔过滤后进样[12]。 采用GPC 软件处理数据，通过标准曲线方程计算样品的相对分子质量及其分布。 色谱条件：色谱柱TSKgel 2000SWXL（300 mm×7.8 mm），流动相V（乙腈）∶V（水）∶V（三氟乙酸）=40∶60∶0.1，UV 检测波长220 nm， 流量0.5 mL/min，柱温30 ℃。

1.3.4 游离氨基酸的测定 取液体样品3 mL，用三氯乙酸（10 g/dL）稀释3 倍后于室温下超声20 min，以10000 r/min 离心10 min。取400 μL 上清液进样检测。色谱条件：色谱柱ODS Hypersil（250 mm×4.6 mm×5 μm），柱温40 ℃；流动相：A 相为0.6 mmol/L乙酸钠，B 相为0.15 mmol/L 醋酸钠、甲醇、乙腈（体积比1∶2∶2）；流量为1.0 mL/min[13]。

1.3.5 挥发性风味成分分析 称3.0 g 样品于15 mL 气质瓶中，加入2 μL 1，2-二氯苯甲醇内标溶液（0.056 μg/mL），混匀后迅速密封。采用75 μm CAR/PDMS 萃取头于50 ℃下萃取30 min，250 ℃解吸3 min。 气相色谱条件：毛细管色谱柱为DB-WAX；载气He，流量1.8 mL/min，不分流；程序升温初始柱温40 ℃，保持3 min，5 ℃/min 升温至90 ℃，再以10 ℃/min 的速率升至230 ℃，保持7 min；检测口温度250 ℃。质谱条件：EI 电离源，电子能量70 eV；离子源温度200 ℃，接口温度250 ℃；灯丝发射电流35 μA， 检测器电压1000 V， 扫描范围m/z 35～450[13]。

1.3.6 数据分析 采用Unscramber version 9.7 进行偏最小二乘回归（PLSR）分析，其中PLS2 用于多个因变量与多个自变量之间的相关性分析，PLS1 用于多个自变量对一个因变量的显著性影响分析。 使用SPSS 19.0 软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同温度和时间下美拉德反应产物风味特性的差异

感官评定是食品风味分析中最真实且直接的方法。 采用感官评定对美拉德反应产物风味特性进行分析，可以对其整体风味和各指标的差异做出直观的判断。 不同反应温度和时间下美拉德反应产物的感官评定结果如图1 所示。 温度过低及时间过短会导致反应不完全，这使得体系中会形成明显的生粮食味，100、110 ℃以及60 min 条件下所产生的异味主要来源于此， 除异味以外其他指标评分均不高，导致整体可接受性较差。 随着反应温度的升高和时间的延长， 玉米肽美拉德反应产物的肉香味、醇厚味、持续性和焦香味均不断增强。 这是因为许多风味物质需要一定温度与时间反应生成，当其累积达到一定量才能形成特定的风味轮廓。 有研究表明，美拉德反应过程中形成的含硫化合物，如噻吩和噻唑类化合物对肉香味的形成具有重要贡献[14]。醇厚味是指样品中的浓厚感和复杂感，与味道的持久性相关。 当反应温度达到120 ℃、 时间延长至120 min 及以上时， 美拉德反应产物的肉香味和醇厚味明显增强。 焦香味则来源于呋喃和呋喃酮等风味物质，主要是由高温促进焦糖化反应及碳水化合物的降解反应所形成[15]。 但温度过高或者反应时间过长又会导致焦糊味和苦味的产生， 温度超过140℃或者反应超过150 min 的美拉德反应产物正是由于受此不良异味的影响，导致整体接受性较差。 有研究发现， 猪骨蛋白质美拉德反应产物在反应40～60 min 时风味最好，时间过长会产生明显的糊味和硫臭味[16]。 因此合理控制反应温度和时间对于玉米肽美拉德反应产物的感官特性非常关键，感官评价结果显示， 于120 ℃温度下反应120 min 可以制备风味特性良好的玉米肽美拉德反应产物。

图1 温度与时间对美拉德反应产物感官特性的影响Fig. 1 Effect of temperature and time on the sensory characteristics of Maillard reaction products

2.2 美拉德反应过程中相对分子质量分布的变化

感官评定法虽然直接、真实且灵敏，但无法解释食品风味的化学本质，结合分子感官技术一起分析，才能更准确地对食品风味进行全面解析。 采用液相色谱对相对分子质量分布进行分析，能明晰美拉德反应过程中肽的降解或交联规律，更准确地评价终产物的风味特性。 不同反应温度和时间下美拉德反应产物的相对分子质量分布结果如表1 所示。由表可知， 玉米肽美拉德反应产物中相对分子质量＜1000 的组分随反应温度升高，相对含量显著增加， 随着反应时间的延长由95.73%逐渐增加至96.65%，说明升高反应温度和延长时间均能加速肽的降解，释放出更多相对分子质量较小的肽和游离氨基酸。当反应温度从100 ℃上升至140 ℃时，相对分子质量1000～5000 组分的相对含量减少了1.35%，说明该相对分子质量范围的肽发生了降解，或相互交联形成更大相对分子质量产物，导致此肽段比例略微下降。 120 min 之前相对分子质量1000～5000 组分相对含量不断下降， 之后趋于稳定，说明在该时间点前，相对分子质量1000～5000的肽段反应活性较强， 超过120 min 之后达到了降解与交联的动态平衡。 相对分子质量＞5000 的组分相对含量随着温度的升高与时间的延长，变化趋势较为一致，均呈现略微下降的趋势，但总体变化幅度仅有0.27%和0.26%， 可能是由于小分子肽段的交联与大分子肽段的降解反应达到了动态平衡，使得该组分变化不大。

表1 不同反应温度与时间下美拉德反应产物相对分子质量分布的变化Table 1 Changes of relative molecular weight distribution of Maillard reaction products under different reaction temperature and time

综上可知，所有样品中相对分子质量＜1000 的组分所占比例最大，其次是相对分子质量1000～5000 和相对分子质量＞5000 的组分， 说明在此美拉德反应体系中降解反应占据了优势。 这与牛肉酶解物-木糖美拉德反应体系的研究结果相一致[17]，即随反应温度的升高，肽相对分子质量分布向小肽方向转移。Su 等研究也表明多肽在美拉德反应中同时存在聚合和降解两种反应[18]。 肽在美拉德反应过程中存在两种转化方式，一是直接参与美拉德反应生成风味物质，即肽交联作用；而另外一种途径则是通过热降解产生一些小分子物质，这些小分子物质再参与美拉德反应形成风味物质，即肽降解作用。

2.3 美拉德反应参数对游离氨基酸组成的影响

相比于相对分子质量分布，游离氨基酸含量及组成更能显著影响美拉德反应产物的滋味感官特性[19]。 对不同温度和时间下的美拉德反应产物进行游离氨基酸分析，结果如图2 所示。 由图可知，美拉德反应体系中游离氨基酸的质量浓度随着反应温度的升高和时间的延长， 有着较为一致的变化趋势。 半胱氨酸作为底物参与反应，其变化幅度最大，从100 ℃的0.75 mg/mL 降至140 ℃的0.08 mg/mL，表明温度升高会加快半胱氨酸的消耗速率，提高其利用率。 这与曹长春等研究的反应温度对“半胱氨酸-木糖”体系的影响[20]结论相一致。 说明反应温度是影响底物活性的重要因素之一，高温条件使得非质子化半胱氨酸质量浓度增加，利于反应发生[21]。而随着时间从60 min 延长至180 min， 半胱氨酸质量浓度逐渐下降，由于半胱氨酸对低分子肽之间交联的抑制和对高分子肽降解的促进作用[10]，导致其他游离氨基酸的质量浓度随时间延长而逐渐增多，这与相对分子质量分布随时间延长的变化情况相呼应。

图2 温度与时间对体系中游离氨基酸组成与质量浓度的影响Fig. 2 Effect of temperature and time on the composition and mass concentration of free amino acids

Ser、Ala、Thr、Gly、Pro、Lys 等属于甜味氨基酸。Ile、His、Phe、Leu、Val、Arg、Met、Tyr 由于其疏水性较大，呈苦味[22]。而高浓度的Glu 和亲水性氨基酸残基会形成具有鲜味口感的肽[23]，因此Asp 和Glu 属鲜味氨基酸。 如图可知，随着温度的升高和时间的延长，甜味氨基酸与苦味氨基酸质量浓度均呈现先升高后略微降低的趋势， 分别于120 ℃和120 min 时达到最高。 随着反应温度的升高，鲜味氨基酸质量浓度逐渐上升，于140 ℃时达到了0.187 mg/mL。 当反应时间从60 min 延长至120 min 时，鲜味氨基酸质量浓度上升幅度较大，之后则趋于平缓。 游离氨基酸的组成、含量与比例，对食品滋味有重要的影响， 多种氨基酸协同存在才能产生丰富的味感，可以通过改变温度与时间对美拉德反应进行调控，进而获得目标呈味产物。

2.4 反应温度与时间对关键挥发性风味成分的影响

挥发性化合物是美拉德反应产物香气的重要组成部分，决定其整体气味轮廓，常作为评价风味特性的首要因素。 采用SPME-GC-MS 对美拉德反应产物进行分析，研究不同加热温度和时间对其挥发性风味成分的影响。 为便于分析，根据文献报道选取关键挥发性风味成分进行讨论，如表2 所示。

表2 反应温度与时间对美拉德反应产物中关键挥发性风味成分的影响Table 2 Effect of reaction temperature and time on the key volatile flavor compounds of Maillard reaction products

通过比较发现，不同反应温度下的产物，其关键挥发性成分的种类及质量分数不尽相同。 其中含氮和含硫化合物的种类及质量分数均随温度的升高呈增加趋势，这是由于较高的反应温度有利于提高半胱氨酸和羰基化合物的降解和交联反应，促进一些含硫及含氮化合物的聚合[24]。 具有肉香特征风味的噻吩、噻唑及二硫化物类化合物，由含硫氨基酸和美拉德反应中间体反应生成，随温度升高质量分数不断增多， 如检测到的3-甲基噻吩、3-噻吩甲醛、5-甲基-2-噻吩甲醛和2，5-噻吩二甲醛等仅在温度达到120 ℃及以上时才生成，因此高温下制备的玉米肽美拉德反应产物， 具有更突出的肉香味。吡嗪、吡咯类含氮化合物通常具有坚果、烤香和焦香等特征风味。 在温度高于120 ℃的美拉德反应产物中检测到的2-甲基吡嗪和1-糠基吡咯， 随温度的升高而逐渐增多。 呋喃类化合物是由还原糖经脱水、分解以及环化一系列步骤形成的[25]，含硫呋喃类化合物具有明显肉香特征，不含硫的呋喃类化合物则是焦糖香风味的主要贡献者。 结果表明，该类物质在120 ℃及以上制备的美拉德反应产物中才检测出，生成量随温度的升高而逐渐增加。 醛类化合物主要来源于脂肪氧化及氨基酸的降解，检测到的醛类物质主要为异戊醛和苯甲醛，以及少量呈青草气味的己醛。 醇类化合物的风味阈值相对较高，在整体风味中起协同作用，主要以正己醇、薄荷醇和糠醇为主， 作为风味前体物质参加到后期的反应中。 除此以外，还检测到大量的酮类、酚类、酸类等化合物， 反应温度对其生成量也具有一定的影响。虽然这些物质对风味没有直接的贡献，但其中的部分化合物是形成杂环化合物的重要中间体，因此可以为整体风味的形成奠定基础[26]。

反应时间对关键挥发性风味成分的影响也较为显著。 时间控制在120 min 以内的玉米肽美拉德反应产物中各类挥发性成分的生成量相当，当反应达到150 min 时，各类化合物的生成量大幅度上升，产生了非常明显的变化。 不同反应时间制备的美拉德反应产物中，含氮化合物、不含硫呋喃类化合物、含硫化合物以及醛类、醇类和酚类化合物，其生成量与时间呈正相关。 此外，有机酸的生成量随反应时间的延长有所上升，这也是美拉德反应体系在反应过程中pH 不断下降的主要原因。 酯类和酮类化合物的生成量是随反应时间的延长，呈现出先增多后减少的趋势。 这与何保江等研究的时间对Maillard 模型体系挥发性产物的影响[27]结果相一致。说明过长的反应时间会导致部分挥发性成分的分解或再反应，最终影响其呈香特性。 总的来说，反应时间对挥发性风味成分的生成具有一定的影响，时间过短不足以形成某些化合物，但若一味地延长反应时间，又会导致部分化合物的过度积累或分解，使得风味物质失衡，最终影响总体的风味轮廓。

2.5 风味成分对感官特性的贡献性分析

2.5.1 风味成分与感官特性的相关性分析 采用PLSR 方法分析各样品的风味成分与感官特性之间的相关性，以相对分子质量分布、游离氨基酸（FAA）质量浓度、 各类挥发性化合物质量分数作为X 变量，以感官评分作为Y 变量。 根据RMSE 值和解释方差大小确定3 为最优主成分个数， 建立了PC1-PC2 和PC2-PC3 模型，分析发现PC2-PC3 模型提供的可用相关性信息包含于PC1-PC2 分析模型中，因此只讨论PC1-PC2 模型。图3 所示为相关性分析载荷图，PC1-PC2 模型对X 变量解释方差达74%，对Y 变量解释方差为70%。 图中，两个椭圆分别代表PLSR 模型50%与100%的解释方差，标记有小圆圈的为具有显著性的变量。 从图中可以看出，相对分子质量1000～5000、＞5000 肽段沿着PC1 均分布于载荷图左侧，相对分子质量＜1000 肽段、FAA 质量浓度、各类挥发性化合物质量分数及感官指标均分布于载荷图右侧，说明游离氨基酸、挥发性化合物等相对分子质量较小的组分与感官特性的相关性较大。 沿着PC2 轴方向，所有风味成分自下而上分布，而感官指标除异味外，均位于下方。 所有的X和Y 变量都位于R2=50%和R2=100%的椭圆之内，说明PLSR 模型能够对各样品的风味成分及其感官特性具有良好的解释能力。

图3 风味成分与感官特性的PLSR 相关分析载荷图Fig. 3 PLSR correlation loadings plot for flavor components and sensory characteristics

2.5.2 风味成分对感官特性的显著性影响分析为进一步明确样品的风味成分对感官指标的显著性影响，进行PLS1 分析，其中图4 中灰色柱形图表示为显著性相关。如图4（a）所示，呋喃类、含硫以及酮类化合物与肉香味表现出显著的正相关。 酮类化合物对反应产物肉香味的形成必不可少[28]。 含硫的杂环化合物对烤香和肉香具有很大贡献，有研究表明含硫呋喃类物质是对肉类风味形成作用最大的化合物[29]。除关键挥发性风味成分以外，相对分子质量＜1000 肽段和FAA 质量浓度也与肉香味呈显著正相关， 相对分子质量1000～5000 肽段与肉香味呈显著负相关，说明许多小分子氨基酸和肽对于肉味的形成具有一定贡献。 图4（b）显示，呋喃类化合物与焦香味呈显著正相关， 这与Tressl 等研究的结论[25]相一致，醛类和醇类与焦香味呈显著负相关；相对分子质量＜1000 肽段和FAA 质量浓度对焦香味有显著贡献，说明美拉德反应对焦香味的形成具有举足轻重的作用。由图4（c）和（d）可知，风味成分对醇厚味和持续性的贡献较为一致，醇厚味与持续性均与相对分子质量＜1000 肽段呈显著正相关，而与相对分子质量1000～5000 肽段呈显著负相关，这是由于醇厚味描述的是样品浓厚的复杂感，与味道的持久性相关。 图4（e）显示，含硫化合物与异味呈显著正相关，有研究发现美拉德反应产物的异味大多是一种焦糊味与硫臭味[16]。

图4 风味成分对感官特性的显著性影响分析Fig. 4 Analysis of the significant influence of flavor components on sensory characteristics

3 结语

以玉米肽-木糖-半胱氨酸为反应体系，考察了反应温度和时间对美拉德反应产物风味特性的影响。 结果表明，随着温度的升高和时间的延长，肉香味、醇厚味和焦香味均有所提升，温度在120～130 ℃，时间在120～150 min 感官整体接受度评分较高。 温度的提高促进了体系的降解反应，提高了半胱氨酸的消耗速率，使得呈味氨基酸总量逐渐上升，含氮、含硫化合物以及呋喃类、酸类、酚类物质的种类及质量分数不断增加。 反应时间的延长亦能在一定程度上增强玉米肽美拉德产物的风味特性，其呈味氨基酸总量的变化、 关键挥发性风味成分的累积趋势， 均与温度升高对风味特性的影响效果相类似，尤其是150 min 之后挥发性风味成分的种类及质量分数大幅度增加。 风味成分的组成是影响感官特性的最直接因素，PLSR 分析结果表明，多种关键挥发性风味成分、 游离氨基酸质量浓度和相对分子质量＜1000 的肽段对肉香味和焦香味的形成具有积极显著的贡献，相对分子质量＜1000 的肽段与醇厚味和持续性呈显著正相关，而含硫化合物则对异味具有重要影响。 该研究可为不同风味特性玉米肽美拉德反应产物的定向制备提供理论基础。