枸杞酸奶体外抗氧化活性和保肝功能研究

范亦菲， 郭 琳， 靳文会， 丁玘颖， 冯雨萌，信晶晶， 董祥晖， 段文慧， 刘 蕾， 耿 燕*

（1. 江南大学 生命科学与健康工程学院，江苏 无锡 214122；2. 江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122）

枸杞为茄科植物，属多年生落叶小灌木[1]，其果实含有丰富的营养成分，如胡萝卜素、甜菜碱、膳食纤维、蛋白质、氨基酸以及多种微量元素等[2]。 据《本草纲目》记载，枸杞具有去疲劳、养肝、明目、抗衰老功效，可令人长寿。 酸奶及相关产品是世界上最常见的消费食品，目前市场常见的酸奶包括果味酸奶、红枣酸奶等[3]，基本属于从改善酸奶风味角度进行的产品创新研发。 其他的研究也包括一些真菌多糖发酵酸奶[4]，但目前关于枸杞发酵酸奶的报道较少。

作者将枸杞原浆添加到酸奶中发酵，通过体外测定添加不同体积分数枸杞原浆的枸杞酸奶的总抗氧化还原能力[5]、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率[6]和羟自由基清除率[7]，以及在动物体内试验中对小鼠血清中谷丙转氨酶 （Cereal third transaminase，ALT）活性、肝脏中脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）含量和谷胱甘肽（Glutathione，GSH）质量摩尔浓度[8]和总抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC）[9]进行检测，以期为保肝功能导向的枸杞发酵乳制品的后续开发提供数据支撑和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备

枸杞原浆： 宁夏华宝枸杞产业有限公司产品；全脂牛奶：内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司产品；酸奶发酵剂（嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌）：安琪酵母股份有限公司产品；白砂糖：安琪酵母股份有限公司产品；铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁、维生素C、DPPH、乙醇、水杨酸、硫酸亚铁、H2O2溶液：国药集团化学试剂有限公司产品；ALT 试剂盒、LPS试剂盒、GSH 试剂盒、T-AOC 试剂盒：上海泰坦科技股份有限公司产品。

酸奶发酵机： 河南星乐斯美电器有限公司产品；酶标仪：美国Bio-Rad 公司产品；HH-S4 数显恒温水浴锅：上海越众仪器设备有限公司产品；DF110型电子分析天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司产品；CT15RE 台式冷冻离心机：日本日立公司产品。

C57BL/6 小鼠： 南京集萃药康生物科技有限公司提供。

1.2 枸杞酸奶制备

取5 个一次性发酵袋，标号为1～5，各加入100 mL 的全脂牛奶和6 g 白砂糖。 1 号作为空白对照不加入枸杞原浆，2、3、4、5 号分别添加体积分数2%、4%、8%、10%的枸杞原浆。 对5 组样品进行混匀，在40～50 ℃进行加热搅拌[10]。 巴氏灭菌法对所有样品进行灭菌处理， 控制温度不超过80 ℃， 灭菌30 min。 待温度冷却到40～45 ℃之后，向5 组样品中各加入0.1 g 发酵剂，将所有样品放置在42 ℃的发酵机内发酵6.5 h，后熟24 h[11]。

1.3 枸杞酸奶体外抗氧化活性测定

分别称取发酵后添加不同体积分数枸杞原浆的枸杞酸奶5.0 g， 于离心机4500 r/min 离心10 min，取上清液备用[12]。

1.3.1 总抗氧化还原能力测定 用铁氰化钾法检测总抗氧化还原能力。 取枸杞酸奶上清液0.25 mL，先后向其中加入pH 6.6 的0.5 mL 磷酸缓冲液，0.5 mL 的质量分数1%铁氰化钾溶液，混匀，置于50 ℃水浴20 min 后流水冷却。 再加入0.5 mL 的体积分数10%三氯乙酸溶液， 充分混匀，5000 r/min 离心20 min，取上清液90 μL 于96 孔板中，加入90 μL纯化水以及20 μL 的质量分数0.1%氯化铁溶液，混匀静置10 min，于700 nm 测定吸光度，以超纯水为空白，用VC 做阳性对照[13]。 每个样品设3 组平行。

1.3.2 DPPH 自由基清除率测定 取添加不同体积分数枸杞原浆的枸杞酸奶上清液20 μL， 向其中加入180 μL 的0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液， 避光室温反应30 min，于517 nm 处测其吸光度，记为AS；取20 μL 超纯水， 向其中加入180 μL 的DPPH 乙醇溶液，其吸光度记为A0；取添加不同体积分数枸杞原浆的枸杞酸奶上清液20 μL，向其中加入180 μL乙醇，其吸光度记为AC。 每个样品设3 组平行[14]，测定DPPH 自由基清除率（I）。

1.3.3 羟自由基清除率的测定 取50 μL 添加不同体积分数枸杞原浆的枸杞酸奶上清液， 加入50 μL 的9 mmol/L 的水杨酸-乙醇溶液， 混匀后加入50 μL 的9 mmol/L 的硫酸亚铁溶液和50 μL 的9 mmol/L 的H2O2溶液，充分混匀后静置30 min 并测定混合液在510 nm 处吸光度[15]，记为AS1；取超纯水为空白对照，其吸光度记为A01。 每个样品设3 组平行，测定羟自由基清除率（Q）。

1.4 枸杞酸奶的动物评价

将25 只 体 质 量 为18 ～22 g、5 周 龄 的 雌 性C57BL/6 小鼠，按体质量随机分成正常对照组、模型组、阳性对照组、酸奶组和枸杞酸奶组，均以标准饲料喂养，无菌水供其自由饮用。 其中阳性对照组每日以10 μL/g（以小鼠体质量计）灌胃联苯双酯，酸奶组每日以10 μL/g（以小鼠体质量计）灌胃不加枸杞原浆的酸奶，枸杞酸奶组每日以10 μL/g（以小鼠体质量计）灌胃添加体积分数10%枸杞原浆的枸杞酸奶；正常对照组第14 天晚上以10 μL/g（以小鼠体质量计）灌胃无菌水，模型组、阳性对照组、酸奶组和枸杞酸奶组第14 天晚上以一次经口灌胃乙醇0.012 mL/g（相当于4800 mg/kg，以小鼠体质量计）。第15 天采用体积分数为1%的戊巴比妥钠溶液对小鼠进行腹腔注射，使其麻醉。 小鼠眼球取血置于离心管中，4 ℃静置30 min 后，4000 r/min 离心15 min，取上清液得到血清，于-80 ℃冰箱保存备用。辅以二氧化碳安乐死，继而对小鼠进行解剖取肝脏组织装于1.5 mL 的EP 管中液氮急冻后，于-80 ℃冰箱保存。 按照试剂盒说明书方法检测小鼠肝脏中ALT 活性、LPS 含量、GSH 质量摩尔浓度[16]和总抗氧化能力。

1.5 数据分析

所有实验数据均采用GraphPad Prism 和Microsoft Excel 2016 软件进行统计处理与作图分析，统计方法采用t 检验分析进行组间比较，*P＜0.05则认为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 枸杞酸奶体外抗氧化活性测定结果

2.1.1 总抗氧化还原能力测定 以维生素C（Vitamin C，VC）为标准品建立VC 质量浓度与总抗氧化还原能力吸光度之间的关系， 得回归方程y=4.5174x＋0.0782（R2=0.9936），线性良好，可用于衡量各样品中的总抗氧化还原能力（每100 g 酸奶中所含VC 的质量）[17]。

由图1 可见， 添加体积分数2%～8%枸杞原浆的枸杞酸奶同未加枸杞原浆的原味酸奶相比，其总抗氧化还原能力有极显著地提高，且有剂量依赖性（***P＜0.001）。但添加体积分数10%枸杞原浆的枸杞酸奶与添加体积分数8%枸杞原浆的枸杞酸奶相比，其总抗氧化还原能力升高并不显著（*P＞0.05）。总之，在枸杞原浆添加一定体积分数范围内，枸杞酸奶总抗氧化还原能力随枸杞原浆添加体积分数的增加而增加，即枸杞酸奶的总抗氧化还原能力随枸杞原浆添加体积分数的增加而增加[18]。

图1 添加不同体积分数枸杞原浆的枸杞酸奶对总抗氧化还原能力的影响Fig. 1 Effect of different content of Lycium barbarum yogurt on total antioxidant reduction capacity

2.1.2 DPPH 自由基清除率测定 由图2 可见，添加体积分数2%～10%枸杞原浆的枸杞酸奶同未加枸杞原浆的原味酸奶相比，其DPPH 自由基清除率均有很显著提高（**P＜0.01），表明添加了枸杞原浆的枸杞酸奶其DPPH 自由基清除能力显著强于未加枸杞原浆的原味酸奶[19]。 添加体积分数10%枸杞原浆的枸杞酸奶与添加体积分数2%、4%枸杞原浆的枸杞酸奶相比，其DPPH 自由基清除率也显著升高（*P＜0.05）。 在枸杞原浆添加一定体积分数范围内，DPPH 自由基清除率随枸杞添加体积分数的增加而增加；当枸杞原浆添加体积分数为10%时，DPPH 自由基清除率高达87.52%。

图2 添加不同体积分数枸杞原浆的枸杞酸奶对DPPH 自由基清除率的影响Fig. 2 Effect of different content of Lycium barbarum yogurt on the scavenging rate of DPPH free radicals

2.1.3 羟自由基清除率的测定 由图3 所示，添加体积分数2%、4%枸杞原浆的枸杞酸奶同未加枸杞原浆的原味酸奶相比，其羟自由基清除率均有很显著地提高（**P＜0.01）；添加体积分数8%、10%枸杞原浆的枸杞酸奶比原味酸奶的羟自由基清除率有极为显著地提高（***P＜0.001），表明添加枸杞原浆的枸杞酸奶其羟自由基清除能力均显著强于未加枸杞原浆的原味酸奶[20]。其中，添加体积分数10%枸杞原浆的枸杞酸奶与添加体积分数2%～8%枸杞原浆的枸杞酸奶相比， 其羟自由基清除率升高也很显著（**P＜0.01）。 在枸杞原浆添加一定体积分数范围内，羟自由基清除率随枸杞原浆添加体积分数的增加而增加[21]；当枸杞原浆添加体积分数为10%时，羟自由基清除率可达76.45%。

图3 添加不同体积分数枸杞原浆的枸杞酸奶对羟自由基清除率的影响Fig. 3 Effect of different content of Lycium barbarum yogurt on hydroxyl radical scavenging rate

2.2 枸杞酸奶的动物评价结果

2.2.1 小鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）活性检测结果谷丙转氨酶主要存在于肝细胞浆内，细胞内浓度比血清中高1000～3000 倍。仅有体积分数为1%的肝细胞被破坏，就可以使血清中酶含量增高一倍。 因此，小鼠血清中ALT 活性作为小鼠肝功能损伤的重要检测指标。 由图4 可知，急性酒精性肝损伤模型组小鼠血清ALT 活性较正常对照组显著升高 （*P＜0.05），为乙醇导致肝细胞损伤所致。与模型组比较，阳性对照组的血清ALT 活性显著降低（*P＜0.05）。枸杞酸奶组与模型组相比，其血清中ALT 活性下降较明显，显示枸杞酸奶可能会对急性酒精性肝损伤小鼠的肝脏有一定的保护作用。

图4 枸杞酸奶对急性酒精性肝损伤小鼠血清中ALT 活性的影响Fig. 4 Effect of Lycium barbarum yogurt on serum ALT level in mice with acute alcoholic liver injury

2.2.2 小鼠肝脏中脂多糖 （LPS） 含量检测结果LPS 可诱导急性肝损伤的发生。由图5 可知，急性酒精性肝损伤模型组小鼠肝脏中LPS 含量较阳性对照组有所升高。 与正常对照组和模型组相比，枸杞酸奶组的LPS 含量略降低。 需要注意的是，与模型组相比，酸奶组的LPS 含量有略微升高，可能是由于酸奶中脂肪含量较高。 但枸杞酸奶组与酸奶组相比，其肝脏中LPS 含量显著下降，表明枸杞作为功能成分添加到发酵酸奶中有可能会通过降低LPS含量从而影响急性酒精性肝损伤程度。

图5 枸杞酸奶对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏中LPS 含量的影响Fig. 5 Effect of Lycium barbarum yogurt on LPS level in liver of mice with acute alcoholic liver injury

2.2.3 小鼠肝脏中谷胱甘肽（GSH）质量摩尔浓度的检测结果 谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合，含有巯基的三肽，由于谷胱甘肽本身的解毒和抗氧化能力，使得谷胱甘肽具有重要的保肝护肝作用[22]。 由图6 可知，与正常对照组比较，酸奶组和枸杞酸奶组的GSH 质量摩尔浓度均显著提高（*P＜0.05）， 其中枸杞酸奶组的GSH 质量摩尔浓度比酸奶组的升高更为明显，表明枸杞酸奶很可能通过提高肝脏中GSH 质量摩尔浓度从而提高小鼠肝脏的抗氧化能力。

图6 枸杞酸奶对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏中GSH 质量摩尔浓度的影响Fig. 6 Effect of Lycium barbarum yogurt on GSH content in liver of mice with acute alcoholic liver injury

2.2.4 小鼠肝脏总抗氧化能力（T-AOC）检测结果总抗氧化能力越强，肝脏损伤程度越小。 由图7 可知，与模型组相比，枸杞酸奶组的肝脏T-AOC 值有所提高，表明枸杞酸奶可能会提高肝脏总抗氧化能力[23]。

图7 枸杞酸奶对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏总抗氧化能力的影响Fig. 7 Effect of Lycium barbarum yogurt on total antioxidant capacity in liver of mice with acute alcoholic liver injury

3 结语

作者将枸杞原浆作为功能成分添加到酸奶中进行发酵， 在枸杞原浆添加一定体积分数范围内，枸杞酸奶总抗氧化还原能力、DPPH 自由基清除率和羟自由基清除率均随枸杞原浆添加体积分数的增加而增加； 当枸杞原浆添加体积分数为10%时，其总抗氧化还原能力为2.81 mg/hg （以酸奶质量计），DPPH 自由基清除率高达87.52%，羟自由基清除率可达76.45%。 在动物体内试验中，枸杞酸奶可以降低小鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）活性，降低肝脏中脂多糖（LPS）的含量，提升肝脏的总抗氧化能力 （T-AOC）， 并且可显著提高肝脏中谷胱甘肽（GSH）的质量摩尔浓度，因此枸杞酸奶可能对乙醇引起的急性肝损伤具有辅助保护作用。 综上所述，枸杞酸奶表现出较强的体外抗氧化活性和一定的肝脏保护功能，可为日后开发出具有解酒保肝功能的枸杞发酵乳制品提供一定的数据支撑和理论依据。