绒毛组织活检联合血清miR-423检测在高危孕妇产前诊断中的价值

宋 冉,李继霞,何 琳,刘 丹,杨志峰,焦 颖

河北省保定市第二医院：1.妇科；2.产科，河北保定 071000

孕妇染色体异常是造成胎儿早产、流产及死胎的重要因素，在孕期进行染色体检查对于优生优育具有重要价值[1]。流行病学调查显示[2]，我国的出生缺陷新生儿比例可达到4%～6%。所以，通过产前诊断可以提升人口质量，产前诊断的方法是目前临床研究的热点之一。目前，国内对于高危孕妇的确诊主要依靠中孕期及孕晚期进行羊水穿刺或者脐带穿刺来获取标本并进行检测[3]。但是，这种方法对于早期异常情况检出的灵敏度较差，同时可能会对孕晚期孕妇的心理造成影响[4]。胎盘绒毛组织活检主要是对孕周为11～13周的孕妇进行产前诊断[5]，对于重型珠蛋白生成障碍性贫血(以下简称“地贫”)及常见的染色体疾病可做到产前诊断，以便及早干预，减少孕妇中晚期的并发症。微小核苷酸(miRNA)主要存在于机体的真核细胞中，母体血清miR-423对于神经管缺陷的诊断具有明确价值[6]。本研究将绒毛组织活检联合血清miR-423检测用于高危孕妇的产前诊断，旨在为临床诊断提供科学依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 将2018年2月至2021年3月于本院诊治的高危孕妇共120例纳入研究作为高危组，年龄25～36岁、平均(29.57±2.09)岁，体质量指数为(25.25±2.18)kg/m2，孕周为(12.09±0.89)周，其中唐氏综合征26例，东南亚缺失型α地贫13例，其他α地贫19例，β41-42杂合子型β地贫12例，β654杂合子型β地贫15例，β28杂合子型β地贫11例，β17杂合子型β地贫9例，其他β地贫15例。另外，选取同期正常妊娠的孕妇120例作为对照组。两组年龄、孕周、体质量指数等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有纳入研究者均签署知情同意书，本研究经本院伦理委员会审批通过(伦理批号为20180201)。纳入标准：(1)年龄在40岁以下；(2)孕周为11～13周。排除标准：(1)有唐氏综合征生育史者；(2)妊娠期糖尿病患者；(3)自身免疫性疾病患者；(4)有长期不良嗜好者，包括吸毒、酗酒等。

1.2方法 在超声引导作用下，嘱受检孕妇膀胱充盈，使用绒毛组织活检针经宫颈进入胎盘内，使用负压注射器进行绒毛组织吸取。在无菌条件下，使用无菌生理盐水对受检孕妇的绒毛组织进行洗净，对红细胞及虹膜组织进行清除后，在倒置的显微镜下进行观察，确认留下的组织仅为绒毛组织。然后，将绒毛组织使用无菌剪刀进行剪碎后，加入到培养瓶中进行培养，培养环境条件设定为温度37 ℃，二氧化碳浓度设定为5.5%，培养时间设定为10 h，在培养结束后，在瓶壁上发现5团以上的大克隆既可以收获细胞。在收获的细胞中加入秋水仙素后继续进行培养，培养时间设定为4～6 h，在常规状态下对以上组织进行G显带，每位受检者的计数为30个分裂相，至少对受检者的5个核型进行分析，在检测过程中，如果出现嵌合体则需要进行扩大计数。随后对绒毛组织的DNA进行提取，然后进行DNA诊断。

血清miR-423检测：所有研究对象均在入组后采集血液4 mL，3 000 r/min离心10 min取上清液，将样品立即置于无DNA酶和RNA酶的灭菌采血真空管内，将所得样品在离心(3 000 r/min，20 min)后，按照Trizol试剂(上海联硕生物科技有限公司)说明书提取血清总RNA，以5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTC CGAGGTGCACTGGATACGACTTCAGTT-3′为引物，采用实时荧光定量PCR(qPCR)进行检测。检测前使用紫外分光光度计进行miR-423浓度和纯度的测定。

1.3观察项目 (1)绒毛组织活检与临床最终诊断结果的一致性。(2)两组血清miR-423水平。(3)联合检测的效能：采用受试者工作特征(ROC)曲线来分析绒毛组织活检联合血清miR-423检测用于高危孕妇产前诊断的效能。灵敏度=100%×真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数),特异度=100%×真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数),符合率=100%×(真阳性例数+真阴性例数)/总例数，阳性预测值=100%×真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)，阴性预测值=100%×真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)。

2 结 果

2.1观察绒毛组织活检与临床最终诊断结果的一致性 绒毛组织活检对于唐氏综合征、东南亚缺失型α地贫、其他α地贫、β41-42杂合子型β地贫、β654杂合子型β地贫、β28杂合子型β地贫、β17杂合子型β地贫、其他β地贫、无异常的诊断与临床最终诊断结果的一致性较好，见表1。

表1 绒毛组织活检与临床最终诊断结果的一致性观察(n)

2.2两组患者的血清miR-423水平比较 高危组血清miR-423相对表达水平低于对照组(0.55±0.18vs.2.28±0.16,t=78.691，P<0.001)。

2.3联合诊断效能分析 绒毛组织活检联合miR-423检测联合用于高危孕妇产前诊断的特异度高于单独检测(P<0.05)，见表2。

表2 联合诊断效能分析

2.4ROC曲线分析 ROC曲线分析显示，绒毛组织活检联合miR-423检测用于高危孕妇产前诊断的曲线下面积大于单独检测，见表3。

表3 ROC曲线分析

3 讨 论

产前诊断对于高危孕妇具有重要意义[7]，决定了是否会对胎儿进行干预。目前受到产前诊断设备及实验技术的限制，国内用于胎儿产前诊断的技术较为滞后[8]。在对患者早孕期绒毛组织的取材中，由于取材的绒毛组织较少，而且受到母体其他组织污染的可能性较高，术后并发症发生的风险较高，各个机构对于绒毛组织的培养及染色体制备开展得不够，这导致胎儿的遗传性诊断存在一定不足。所以，在对高危孕妇的诊断中，及时有效地通过和其他指标的联合使用以提升诊断效能[9]。在对孕妇绒毛组织进行取材的过程中，有可能会导致宫内感染、阴道出血及流产等。在诊断能力较高的产前诊断中心，通常在早孕期(孕11～13周)对患者进行绒毛组织的取材，导致胎儿流产概率与既往的羊膜腔穿刺相当；而在对孕10周的孕妇进行绒毛组织取材时，胎儿发生横向肢体短缺畸形的风险为1%～3%[10]，同时下颌肢体发育不良的风险显著升高；在孕11～13周进行绒毛组织的取材，相对安全[11]。所以本研究选择在孕11～13周对孕妇进行绒毛组织取材。在实际的检测过程中，首先在B超的引导作用下，对孕妇进行绒毛组织进行采集，一方面可以避免引起胎儿的肢体发育障碍，同时孕11周的绒毛组织较为丰富，有助于B超下进行穿刺[12]。笔者发现在对患者绒毛组织进行取材过程中，在子宫前壁更容易到绒毛组织，但是当患者的子宫过度倾/屈时则存在一定的难度[13]。所以在实际的取材过程中，及时对患者的腹部进行加压，同时嘱患者进行膀胱充盈，必要时通过手法对子宫位置进行调整，有助于提升绒毛组织取材的成功率[14]。

本研究结果显示，绒毛组织活检与临床最终诊断结果的一致性较好，但是仍存在一定的差异，所以在产前诊断过程中，可以联合其他指标，提升诊断效能。已有的研究报道显示[15]，孕妇血清中的miRNA主要是来自于造血细胞，与妊娠密切相关，同时miRNA的稳定性较好，其检测便于在临床开展。所以，探讨血清miR-423检测在产前诊断中的应用，对于高危孕妇的产前诊断具有重要意义。有研究报道，产后母体血清miRNA会被快速清除，所以孕妇血清miRNA的检测有望成为高危孕妇诊断的重要依据。有研究发现，在神经管缺陷胎儿的母体血清中miR-423水平呈显著下降[6]。在本研究中，通过对研究对象进行绒毛组织活检和miR-423水平的联合检测，提升了产前诊断的效能。但是本研究还存在一定的局限性，例如纳入本研究的样本量较小，还有待进一步地扩大样本量进行验证。

综上所述，绒毛组织活检联合血清miR-423检测在高危孕妇产前诊断中的效能较高。