骨髓涂片细胞学检查与流式细胞免疫分型检测结果不相符分析

金咏梅,刘雨涵,廖红艳,蒋能刚

四川大学华西医院实验医学科，四川成都 610041

白血病是造血系统的一种恶性疾病，在我国各年龄段恶性肿瘤的病死率较高，35岁以下人群病死率占据首位[1]。由于白血病是累及造血干细胞的异常克隆性病变,具有高度异质性,传统的法、美、英分型系统(即FAB分型系统)的形态学分型是一种诊断白血病分型的重要方法。随着科学技术的发展进步,应用形态学、免疫学、细胞遗传学、分子生物学方法对白血病进行分型,提高了对其诊断效率,在白血病疗效观察和预后监测方面也具有重要的临床意义[2]。骨髓涂片细胞学检查虽然误诊率、漏诊率较高，但其对于具有典型细胞特征的疾病有着较好的识别度。本文旨在通过对5 373例疑诊血液病患者骨髓涂片细胞学检查与流式细胞免疫分型检测结果不相符的原因进行回顾性分析，以达到提高二者的一致率、改进检验服务质量的目的。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年3月至2020年3月由本科接收且具有骨髓涂片细胞学检查及流式细胞免疫分型检测结果的疑诊血液病患者5 373例作为研究对象。所有研究对象诊断结果由实验室信息系统导出，且均为本院根据形态学、细胞组化、细胞免疫学、分子遗传学等方法确诊的门诊或住院患者。

1.2标本采集 研究对象俯卧位取髂后上棘，特殊情况取髂前上棘无菌操作抽取0.2 mL骨髓制作骨髓涂片供细胞形态分析。另将2.0 mL骨髓液注入肝素钠抗凝管中，混匀后进行流式细胞免疫分型检测。

1.3仪器与试剂 流式细胞仪使用美国BD公司的产品，型号为FACS CantoⅡ。仪器使用的鞘液、破膜剂、溶血剂及单克隆抗体均由美国BD公司提供。

1.4方法

1.4.1骨髓涂片细胞学检查 骨髓涂片加瑞氏姬姆萨混合染液3～5滴，覆盖骨髓膜整体，稍等20 s 后加缓冲液6～8滴混匀，染色时间为15～20 min，用流动的水从玻片的一侧冲洗染液，待其自然干燥或者用吸水纸吸干后镜检。(1)低倍镜：观察材料、涂层、染色是否合格，根据镜下骨髓渣旁造血组织、脂肪组织的比例判断有核细胞增生情况。首先观察巨核细胞的数量及骨髓涂片边缘和尾部是否有大的或多个特殊的病理细胞。(2)使用油镜分类200个有核细胞(不包括有丝分裂的细胞和破碎的细胞)。根据各种细胞的类型和发育阶段的记录，计算其百分率，并仔细观察各个系、各个阶段的细胞形态是否处于正常。根据有核细胞增生程度和白血病细胞所占比例，通过世界卫生组织(WHO)形态学分型标准对细胞形态进行分析。

1.4.2流式细胞免疫分型检测 采用SSC/CD45设门和若干个带荧光标记的单克隆抗体检测患者骨髓细胞的抗原表达。阳性判断标准：对一般细胞膜抗原阳性细胞>20%为阳性，对CD34和胞浆抗原>10%为阳性。确定细胞类型参照欧洲白血病免疫学分型研究组制定的积分系统，计算各个抗原的细胞系列积分并进行判断。

2 结 果

2.1检测结果总不相符的病例情况 研究对象中骨髓涂片细胞学检查与流式细胞免疫分型检测结果总不相符的病例共352例(6.55%)，其中包括急性白血病病例、检出异常细胞病例、其他病例。

2.2检测结果不相符的急性白血病病例情况 研究对象中骨髓涂片细胞学检查与流式细胞免疫分型检测结果不相符的急性白血病病例共32例，包括24例急性髓系白血病(AML)病例，8例急性淋巴细胞白血病(ALL)病例。见表1。

表1 检测结果不相符的急性白血病病例情况

2.3检测结果不相符的异常细胞病例情况 研究对象中骨髓涂片细胞学检查与流式细胞免疫分型检测结果不相符的异常细胞病例共318例，占总不相符病例的90.34%。其中骨髓涂片细胞学检查结果为异常浆细胞，而流式细胞免疫分型检测结果为异常B淋巴细胞、异常T淋巴细胞、淋巴细胞增殖性疾病(LPD)、未见异常的病例共14例；骨髓涂片细胞学检查结果为未见异常，而流式细胞免疫分型检测结果为异常原始粒细胞、异常B淋巴细胞、异常T淋巴细胞、异常浆细胞、异常单核细胞、异常自然杀伤细胞(NK细胞)、LPD病例共216例；骨髓涂片细胞学检查结果为其他异常，流式细胞免疫分型检测结果为未查见异常表型细胞病例共88例。见表2。

表2 两种方法检测结果不相符的异常细胞病例情况

续表2 两种方法检测结果不相符的异常细胞病例情况

2.4检测结果不相符的其他病例情况 研究对象中骨髓涂片细胞学检查结果为增生性贫血而流式细胞免疫分型检测结果为异常浆细胞和异常B淋巴细胞病例共2例。

3 讨 论

骨髓涂片细胞学检查是一种检查血液疾病及多种疑难杂症的重要手段，同时也是多种疾病预后、骨髓造血功能恢复效果的重要判断指标之一[3]。它能够通过简易的工具制片,再由显微镜人工观察骨髓细胞的形态、数量、分类、比例，从而得出相应诊断，该检查方法以细胞形态为分型依据[4-5]。在实际的临床工作中，骨髓涂片细胞学检查结果易受到多种因素的影响，导致结果出现明显差异，加之各实验室的结果缺乏认同性，容易造成对疾病的漏诊、误诊[6-7]。随着流式细胞免疫分型检测应用于临床，其对于白血病的诊断起到了重要作用。它能够快速地对细胞及亚细胞的构造进行检测，能够更好地认知健康状态下的造血系统，并能对具有明确免疫表型特点的血液恶性疾病进行描述。流式细胞免疫分型检测的优点主要为检测速度快、测量指标多、灵敏度高等，提高了异常细胞计数准确性、精密度且能报告多项研究参数[8-9]。白血病细胞分为B淋巴细胞系、T淋巴细胞系、髓细胞系及红细胞系和巨核细胞系，每种细胞系所表达抗原的不同是区分白血病细胞的关键[10-11]。这些免疫标志物能够反映正常细胞在变为恶性肿瘤过程中细胞基因及抗原标志所发生的变化，而这种细微变化在显微镜下无法进行有效辨别。尤其是当骨髓涂片细胞学检查对异常细胞难以区别时，各种血液肿瘤的诊断、鉴别诊断就主要依赖于流式细胞免疫分型检测。

研究对象中骨髓涂片细胞学检查与流式细胞免疫分型检测结果不相符的AML病例共24例，其不相符原因主要体现在白血病细胞的形态识别，尤其是在有单核细胞成分的AML-M4/M5中。流式细胞免疫分型通过对特异性的荧光抗体进行检测，直指白血病细胞本质，能够更好地对是否有单核细胞进行判定，此种情况下建议骨髓涂片细胞学结合流式细胞免疫分型检测结果进行分析。对于混合细胞型白血病来说，其发生率极低，由于是跨系别混合，细胞来源混乱，不能仅依靠骨髓涂片细胞学检查进行分型，而是需要流式细胞免疫分型检测对其进行诊断，同时还需要结合分子遗传学检测。建议骨髓涂片细胞学检查不能明确区分系列的急性白血病病例，应参考流式细胞检测结果进行分型。ALL的白血病细胞个体差异极大，仅凭肉眼难以区别T/B淋巴细胞，亦不能对细胞划分发育阶段。骨髓涂片细胞学检查报告为ALL，临床仍需要流式细胞免疫分型检测结果进一步分型。

对于异常细胞的检测，骨髓涂片细胞学检查与流式细胞免疫分型检测各有优缺点。骨髓涂片细胞学检查观察的视野有限，检测限较低，但对于寄生虫、病原菌及海蓝细胞等形态上明显有别于正常细胞的特殊细胞具有优势。流式细胞免疫分型检测限可以达到10-4，甚至更高，但流式细胞免疫分型检测对异常细胞的判定一般只基于细胞表型，对标本质量要求较高，同时也会受到荧光抗体种类及数量的制约。唯有将两种检测方法结合起来考虑才能进一步提高异常细胞的检出率。

总之，流式细胞免疫分型检测异常细胞既快速且高效，若同时再联合骨髓涂片细胞学检查，可避免由于表面膜抗原标记缺乏或异常细胞在治疗过程中某些标志丢失或改变，或骨髓标本采集时过度稀释等造成流式细胞免疫分型检测结果的假阴性，进一步提高异常细胞检出率，在疾病的疗效评估及预后监测中都具有重要意义[12]。流式细胞免疫分型检测由于其广泛的适用性和快速出检测结果，是微小残留病灶检测的首选方法[13-15]。虽然流式细胞免疫分型检测优点突出，但是骨髓涂片细胞学检查仍然不可抛弃。如何提高骨髓涂片细胞学检查准确性、诊断符合率便是当下需要着重探讨的问题，后期将进一步深入研究。