恒温扩增芯片法在下呼吸道感染病原体检测中的应用

王婷婷,刘怀燕,2,黄家望,敖科萍,王中浩,吴重阳,谢 轶△

1.四川大学华西医院实验医学科,四川成都 610041；2.南充市中心医院检验科,四川南充 637000

环介导等温扩增法(LAMP)作为一种新型的检测技术，具有特异度高、效率高、操作简单等优点，因此在微生物鉴定诊断领域得到了广泛的应用，可用于感染早期或临床症状不明显的疾病检测[1]。恒温扩增芯片法是利用LAMP结合微流控芯片检测下呼吸道常见病原体的一种新技术，该技术针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶的作用下，60～65 ℃恒温扩增，由于其反应过程省略了变性和退火步骤，极大地缩短了检验周期，15～60 min即可实现109～1010倍的核酸扩增[2]。LAMP已被广泛应用于基础医学研究、食物基质中病原体快速筛选、环境病原体检测及致病性病原体的即时检测[3]。下呼吸道感染是临床常见的感染性疾病，可由多种病原体引起，包括常见细菌、真菌、衣原体、支原体及病毒等。细菌传统培养法是临床诊断下呼吸道感染的常用检测手段，但存在阳性率低、检测周期长、容易漏检等问题，并且无法覆盖不能常规培养的病原体，导致许多临床治疗依然需要经验性使用抗菌药物。准确的病原体检测可为临床合理、正确使用抗菌药物提供依据，减少耐药的发生。基于恒温扩增芯片技术的试剂盒可检测下呼吸道13种常见病原体，检测快速、操作简单，具有较高特异度和灵敏度，已广泛应用于临床对于下呼吸道感染的诊断[4]。本研究旨在评价恒温扩增芯片法在下呼吸道感染病原体检测中的临床应用价值，并与其采用细菌传统培养法的检测结果进行比较。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取四川大学华西医院2021年1—6月下呼吸道疑似感染患者1 432例作为研究对象，采集研究对象合格下呼吸道样本，包括合格痰液756例、肺泡灌洗液566例及经气管插管收集的深部气管分泌液110例。研究对象中男性934例(65.2%)，女性498例(34.8%)，年龄1～96岁，中位年龄为62岁。

1.2仪器与试剂 恒温扩增芯片法检测采用北京博奥生物集团有限公司的呼吸道病原菌核酸检测试剂盒。细菌传统培养法应用的血琼脂平板、巧克力平板及麦康凯平板为郑州安图生物工程有限公司产品。细菌鉴定采用生物梅里埃VITEK2 COMPACT全自动细菌鉴定系统及布鲁克科技有限公司基质辅助激光解析飞行时间质谱仪。质量控制菌株采用铜绿假单胞菌ATCC27853、大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923及粪肠球菌ATCC29212。

1.3方法 恒温扩增芯片法样本液化、核酸提取、加样及检测步骤参照试剂盒说明书操作，采用Rtisochip-W 恒温扩增核酸分析仪检测，应用其相应软件进行结果判读。可以检测的病原体包括肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、结核分枝杆菌复合群、肺炎支原体和肺炎衣原体。细菌传统培养法标本接种、分离培养及菌种鉴定按《全国临床检验操作规程》第4版进行，采用全自动细菌鉴定系统及质谱仪进行菌种鉴定。

1.4统计学处理 采用SPSS24.0统计软件进行数据分析，计数资料以例数或百分率表示，两两比较采用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。一致性分析采用Kappa检验，Kappa≥0.75为一致性高，0.40≤Kappa<0.75为一致性一般，Kappa<0.40为一致性差。

2 结 果

2.1研究对象总体检测情况比较 研究对象采用恒温扩增芯片法检测出阳性例数为597例(阳性率为41.7%)，采用细菌传统培养法检测出阳性例数为530例(阳性率为37.0%)，两种方法检测的阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。两种方法检测结果完全相同的病例共有1 003例，检测一致率为70.0%，两种方法检测结果均为阳性，但阳性结果完全不同的病例共有37例(2.6%)。对结果进行进一步分析发现，756例合格痰液样本采用恒温扩增芯片法检测的阳性率(43.5%)高于细菌传统培养法检测的阳性率(36.4%)，差异有统计学意义(P<0.05)；肺泡灌洗液及深部气管分泌液样本采用两种方法检测的阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 两种方法检测阳性率比较[n(%)]

2.2不同种类病原体检测情况比较 两种方法对铜绿假单胞菌检测一致性高(Kappa≥0.75)，对流感嗜血杆菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌及嗜麦芽窄食单胞菌检测一致性低(Kappa<0.40)。见表2。恒温扩增芯片法对鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌及结核分枝杆菌复合群检测阳性率比细菌传统培养法检测阳性率高(P<0.05)，细菌传统培养法检测嗜麦芽窄食单胞菌阳性率比恒温扩增芯片法检测阳性率高(P<0.05)，两种方法检测铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。合格痰液样本的铜绿假单胞菌检测一致性高(Kappa>0.75)，而肺泡灌洗液样本的铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的检测结果一致性均较高(Kappa>0.75)。另外，因深部气管分泌液样本较少未纳入分析。见表3。

表2 两种方法对不同种类病原体的检测情况比较

表3 合格痰液、肺泡灌洗液样本病原体检测情况比较

2.3混合阳性结果检出情况比较 恒温扩增芯片法检测出多种病原体组合的混合阳性率比细菌传统培养法检测的结果高，其中检出肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌和嗜麦芽窄食单胞菌等病原体时，其检测结果较多是同时合并其他病原体的多种菌混合阳性的结果(混合阳性率>60%)；流感嗜血杆菌更多为单一阳性结果。细菌传统培养法与恒温扩增芯片法检测情况不同，肺炎链球菌和嗜麦芽窄食单胞菌培养阳性通常出现在与其他病原体的混合阳性结果中，其他细菌则更多检出为单一阳性结果。恒温扩增芯片法对鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌及金黄色葡萄球菌等病原体的混合阳性率高于细菌传统培养法，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 两种方法检测不同病原体的混合阳性率比较

续表4 两种方法检测不同病原体的混合阳性率比较

2.4恒温扩增芯片法检测病原体分布特点 采用恒温扩增芯片法检出的病原体前5位依次为鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌和金黄色葡萄球菌。对于培养周期长的结核分枝杆菌及无法进行常规培养的几类下呼吸道常见病原体：肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌，恒温扩增芯片法检出结核分枝杆菌阳性共24例，肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌各1例。

3 讨 论

本研究纳入1 432例疑似下呼吸道感染患者，采用恒温扩增芯片法检测的阳性率高于细菌传统培养法，差异有统计学意义(P<0.05)，说明恒温扩增芯片法检测灵敏度更高，这与其他研究报道结果一致[5-7]。细菌传统培养法可能存在假阴性结果，造成假阴性的原因可能是部分患者在检测前接受了抗菌药物治疗，对病原体培养产生抑制作用。尤其在流感嗜血杆菌和肺炎链球菌等检测中，由于其培养要求高、培养过程影响因素多，可导致细菌传统培养法阳性率降低。

除了阳性率差异，两种方法在不同菌种中检测的一致性表现也有差异。有研究报道，恒温扩增芯片法和细菌传统培养法对于铜绿假单胞菌的检测阳性率一致性高，对于肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的检测阳性率一致性较低[8]，与本研究结果一致。由于本研究纳入合格痰液、肺泡灌洗液和深部气管分泌液样本，为明确痰液中口腔正常菌群对病原菌的检出是否有影响，研究进一步做了区分样本类型的检测一致性比较，由于深部气管分泌液样本少未纳入分析，结果表明，肺泡灌洗液样本铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌检测阳性率一致性相比合格痰液有了进一步提高，这与文献[9]研究结果一致。

另外，由于规避了多种病原体共培养的生长竞争问题，恒温扩增芯片法对于鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌及金黄色葡萄球菌等多种病原体混合阳性率较细菌传统培养法更高(P<0.05)，有利于为其感染的可能致病菌提供更为全面的微生物学证据。左丽娜等[10]也报道了相同的结果。此外，有研究报道，恒温扩增芯片法准确度高、灵敏度高、特异度强、反应省时，可以作为肺炎克雷伯菌的快速检测方法[11]。

本研究的病原体包括培养阳性率低、周期长的结核分枝杆菌，无法常规培养的肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌，对于这类病原体，恒温扩增芯片法可显著提高检测灵敏度。国内外已开展了应用LAMP技术在结核分枝杆菌快速诊断中临床价值的研究，结果显示，其检测特异度、灵敏度均较高，分别为96%和80%[12-13]。本研究恒温扩增芯片法检出结核分枝杆菌共24例，采用恒温扩增芯片法检测结核分枝杆菌的阳性率高于细菌传统培养法阳性率，差异有统计学意义(P<0.05)。李辉腾等[14]研究显示，恒温扩增芯片法可快速、准确检测嗜肺军团菌。有研究发现，恒温扩增芯片法对于检测肺炎支原体感染优势明显[15]。本研究检出肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌各1例，为临床感染的诊断治疗提供了较明确的微生物学证据，此类病原体无法常规进行培养，需通过血清学或宏基因组测序(mNGS)等方法进行检测，缺乏金标准，恒温扩增芯片法检测快速、灵敏，是一种可靠的病原学筛查方法。

综上所述，恒温扩增芯片法与细菌传统培养法相比，具有快速、灵敏、高效的特点，可一次性同时检测13种常见呼吸道病原体，检测周期仅需2～4 h，对多种呼吸道病原体检测的阳性率高于细菌传统培养法，恒温扩增芯片法有利于快速诊断下呼吸道感染的真正病原菌，尤其是苛养菌、慢生长菌和不可培养病原体的快速诊断。恒温扩增芯片法也具有自身的局限性，它所包含的13种呼吸道病原体并未完全覆盖呼吸道感染常见细菌，比如阴沟肠杆菌、卡他莫拉菌等，此类病原体的检测仍需依靠细菌传统培养法进行补充。因此，针对疑似下呼吸道感染的患者，建议临床联合应用两种检测方法，充分利用不同方法的优势，为临床诊疗的综合分析提供及时、可靠的依据。