金银花对变异链球菌UA159体外作用的实验研究

龋病是一种常见的口腔疾病，不仅影响口腔健康还会影响咀嚼、消化、语言等功能，甚至导致错 畸形，影响美观

。最近的研究发现龋病与肥胖症有关

。龋病的加重不仅会影响患者的生活质量，还会影响心理健康，甚至与抑郁症有关

。现代药理研究发现金银花是一种具有抗炎

、抗菌、抗肿瘤

、抗病毒

、抗氧化

、保肝

、免疫调节等生物活性的药物。临床上，金银花广泛应用于风热感冒、呼吸道感染、痈肿疔疮、炎症等。有研究发现金银花对葡萄球菌、溶血性链球菌、伤寒杆菌、肺炎球菌等有一定的抑制作用

。金银花制剂现广泛应用于口腔溃疡、牙龈炎、牙周病、牙髓根尖周病，并取得良好疗效，但对龋病的防治方面仍有所欠缺。变异链球菌为龋病的主要致龋菌，它的致龋性主要在于其具有产酸性、耐酸性及黏附力，有研究表明变异链球菌对牙面的黏附是口腔牙菌斑向致龋性菌斑转化的标志，也是其致龋的重要物质基础

。故本研究初步探讨金银花对变异链球菌的抑菌效果，为龋病防治的临床应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验菌株

变异链球菌国际标准株UA159（简称UA159）由四川大学华西口腔医学院国家重点实验室提供。

1.2 主要试剂与仪器

脑心浸液培养基（brian heart infusion, BHI）、磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline, PBS）、2.5%戊二醛、二甲基亚砜（北京索莱宝科技有限公司，中国）；金银花（海门，中国）；结晶紫及标准革兰染色液（上海碧云天生物技术有限公司，中国）；一次性无菌接种环、EP 管、离心管（Bilogix Group，美国）；离心机（安徽中科中佳，中国）；正置显微镜（Olympus，日本）；扫描电子显微镜（FEI，美国）；全波长酶标仪（Thermo，美国）；YQX-Ⅱ厌氧培养箱（跃进，上海）；高压蒸汽灭菌锅（Panasonic，日本）。

1.3 菌株的复苏、培养和鉴定

取冻存变异链球菌UA159 菌株，复苏，划线接种于BHI 琼脂平板，37 ℃恒温厌氧箱（80%N

、10%H

、10%CO

）培养24 h；BHI 液体培养基增菌至对数期；离心，洗涤，重复3 次，稀释重悬，调节菌液OD

=1.0 后再稀释100 倍作为标准菌液。

首先是数据源层，FLUDW的数据源来自于NCBI的GenBank数据库中的流感病毒数据。其次是数据抽取层，根据流感病毒数据的特点，FLUDW的数据抽取器采用高级语言和SQL编程实现，系统通过抽取器定期检测并抽取数据源的更新数据。再次是数据集成层，FLUDW建立了一个便于高效检索的集成数据库。最后是系统应用层，FLUDW的Web页面上提供了高效的检索、序列比对分析等服务。

1.4 金银花药液MIC 值的测定

UA159 为椭圆形，成对或呈短链状分布。在0、6、12 h 三个时间点加入金银花药液后，细菌数量均明显下降，但趋势减缓（图4a～4c）。溶剂组与菌液组均可见菌体大量团聚，无明显差异（图4d、4e）。

1.5 UA159 菌株生长曲线的测定

实验组分别稀释金银花原液至MIC 及以下等比（1/2，1/4，1/8）3 个浓度，取1 mL 分别加入试管后再加入1 mL 标准菌液，菌液对照组则加入等量培养基及菌液。检测培养0、4、8、12、24 h 时各管中液体的OD

值，绘制生长曲线图。

1.6 测定金银花药液对UA159 产酸影响

实验组用BHI 液体培养基（含1%蔗糖）按照1.5 方法稀释金银花原液后分别取4.5 mL 加入试管，再加入标准菌液0.5 mL，菌液对照组加入等量培养基及菌液。每组设6 个平行组，在培养的0、4、8、12、24、48 h 时各组取出一支，离心，测pH值。0 h 时的pH 值作为初始pH 值，计算每个时间段每组的ΔpH 值，绘制产酸变化曲线。

综上所述，倍他乐克联合胺碘酮，临床效果明显，不仅仅能够有效改善急性心肌梗死后室性心律失常患者的临床症状，同时也能显著提高临床疗效，控制不良反应，具有临床应用优势及推广价值。

1.7 测定金银花药液对UA159 黏附影响

实验组按1.6 方法稀释药液后取2.5 mL 加入试管，菌液对照组则加入等量培养基，溶剂对照组加入等量含DMSO 的培养基，再加入2.5 mL 标准菌液，试管倾斜30°，24 h 后取出，将管内液体倒入第二批相对应管中，原试管加入5 mL PBS 摇晃震荡，再将液体吸取至第三批对应的试管中，PBS 溶液再次震荡。将第2、3 批试管离心（3 000 r/min，15 min），吸弃上清液，5 mL PBS 溶液混匀。测各管OD

值。三批试管的数据分别记为X、Y、Z 值，黏附率=X/（X+Y+Z）×100%；黏附抑制率=（菌液对照组黏附率-实验组黏附率）/菌液对照组黏附率×100%。

1.8 金银花药液对UA159 生物膜的影响

与菌液组相比，0、6、12 h 点加入金银花药液组的细菌生物膜形成量下降，差异有统计学意义（

＜0.05），而菌液组与溶剂组间差异无统计学意义（

＞0.05），见表5。

技术人员、业务管理人员等都负有一定的成本控制责任，同时还享有成本控制的权力，对各部门在成本控制中的业绩进行定期的检查和考证，并与工资分配紧密挂钩，实行有奖有罚，才能达到预期的效果，实现对成本的控制.

“教科研+”为培养能“提出问题”和“发现问题”的学生提供了保障，也为培养“研究型”、“专家型”教师提供了有力的条件.

24 h 内不同浓度金银花溶液对UA159 生长影响情况见表2、图1。结果显示：UA159 生长速度随着药液浓度的增加而逐渐变缓。菌液组在前8 h内增长迅速，后逐渐变缓，12 h 后趋于稳定；1/8MIC组与菌液组相比差异无统计学意义（

＞0.05），1/4MIC、1/2MIC、MIC 与菌液组相比每个时间点的差异均具有统计学意义（

＜0.05）。不同药物浓度组组间比较，差异均具有统计学意义（

＜0.05）。

1.9 统计学分析

2 结 果

2.1 金银花药液MIC 值的测定

3.2 词表。词表(Wordlist)属于语料库索引工具的基本功能。它可根据研究要求由词表工具自动排列，如以形符或类符在语篇中出现的频率高低列出，或根据其字母顺序进行排列。

2.2 UA159 生长曲线的测定

1.8.3 SEM 观察金银花药液对UA159 细菌数量的影响 15片氧化锆片打磨抛光，装入瓶内，用20 mL无水乙醇及UP 超纯水进行超声震荡，高压蒸汽灭菌15 min，烘干。取1 个24 孔板，分5 组，每组3 个复孔，放入氧化锆片，重复1.8.2 方法加入菌液及药液，厌氧培养24 h 后取出，吸干液体，充分漂洗；加2.5%戊二醛溶液2 mL，加盖4 ℃固定4 h 后吸净液体，将氧化锆片转入一新的24 孔板内，反复漂洗；随后依次50%、70%、80%、90%酒精梯度脱水各15 min，无水乙醇脱水2 次后干燥。各组选取2 枚，CO

临界点干燥粘台，喷金，扫描电镜镜检，拍照。

2.3 测定金银花药液对UA159 产酸影响

各组pH 值随着时间的推移均呈下降趋势，8 h前速度更快，随后减缓，结果见图2，表3。1/8MIC与菌液组差异无统计学意义（

＞0.05）。MIC、1/2MIC、1/4MIC 组与菌液组相比抑制作用明显，差异均具有统计学意义（

＜0.05）。

2.4 测定金银花药液对UA159 黏附影响

随着金银花药液浓度的增加，UA159 的黏附率下降，黏附抑制率增加，结果如表4。溶剂组与菌液组间的黏附率与黏附抑制率差异无统计学意义（

＞0.05）；不同金银花药液组与菌液组间的黏附率与黏附抑制率差异有统计学意义（

＜0.05）。

2.5 金银花药液对UA159 生物膜形成量的影响

1.8.1 金银花药液对UA159 生物膜形成量的影响 取96 孔板，编号1 ～5 组，每组设3 个复孔，每孔加入100 μL 标准菌液，在培养的0、6、12 h 时分别在1 ～3 组加入100 uL 20 mg/mL 的金银花药液，使最终药液浓度为10 mg/ mL 后继续培养至24 h，4、5 组分别为溶剂对照组及菌液对照组。24 h 后吸弃孔内液体，PBS漂洗，室温干燥，甲醛固定15 min；按照使用说明对标本进行1%结晶紫染色液染色，再次漂洗干燥，加入200 μL 的33%冰乙酸溶液溶解，酶标仪测定每孔OD

值，评估生物膜的形成量。

2.6 变异链球菌生物膜结晶紫染色定性分析

显微镜下观察UA159 菌体呈紫红色，链状或短链状排列，0、6、12 h 加入药液后生物膜形成量均明显下降（图3a～3c）。溶剂对照组（图3d）与菌液对照组（图3e）相比无明显差异。

观察1、2 号试管表现为清亮的淡黄色液体并且不伴沉淀生长，3 ～7 号、菌液及溶剂对照组均表现为不同程度的浑浊或沉淀。ΔOD

值结果见表1，与菌液组相比，1 ～4 号及药液对照组差异有统计学意义（

＜0.05），而5 ～7 号、溶剂对照组差异无统计学意义（

＞0.05），根据结果结合肉眼观察试管内无浑浊或沉淀生长的最低药物浓度即为金银花的MIC，最终测得金银花药液对UA159 的MIC 值为12.5 mg/mL。

2.7 SEM 观察金银花药液对UA159 细菌数量的影响

取500 mg 金银花粉末，加入装有10 mL DMSO溶液的离心管，吹打混匀，最后配置成质量浓度为50 mg/mL 的金银花原液。实验组7 支离心管编号1 ～7，1 号加入金银花原液1 mL，余试管依次按二倍梯度稀释法用1 mL BHI 液体培养基依次按照二倍梯度稀释至药液浓度为25、12.5、6.25、3.125、1.5 625、0.78 125、0.390 625 mg/mL，最后各管均加入1 mL 标准菌液。药液对照组加入1 mL 金银花原液及1 mL 培养基；溶剂对照组加入含DMSO 溶剂的1 mL 培养基和1 mL菌液；菌液对照组加入1 mL菌液和1 mL 培养基。厌氧箱培养24 h，观察培养基情况，以浑浊度为指标检查有无细菌生长，结合酶标仪检测0、24 h 后各试管内的OD

值，0 h 的OD

值为初始值，计算ΔOD

值，确定MIC 值。

1.8.2 变异链球菌生物膜结晶紫染色定性分析取2 个6 孔板，编号1 ～5 组，每组设2 个复孔。每孔放入22 mm×22 mm 灭菌盖玻片一张，加入1 mL标准菌液。按1.8.1 方法在培养的0、6、12 h 于1、2、3 组加入20 mg/mL 的金银花药液，4 组为溶剂对照组，5 组为菌液对照组，1～5 组均培养24 h后取出。吸干，PBS 漂洗，吸出。5 mL 甲醇固定15 min，洗净，风干。1%结晶紫染色5 min，PBS 冲洗，滤纸吸干，正置显微镜镜下观察，拍照记录。

3 讨 论

变异链球菌被认为是非致病性口腔微生物群落向菌斑生物膜过渡过程中最相关的细菌

。变异链球菌具有耐酸性，致使局部牙体组织脱矿，如果不加控制，最终导致龋病产生

。目前临床上普遍使用的氟化物防龋效果是值得肯定的，但氟化物长期使用会带来口腔组织着色、改变味觉等问题，甚至氟中毒等情况的发生。金银花作为天然药物，价格低，产量大，应用领域广泛，安全性高。主要化学成分有挥发油、黄酮类化合物、有机酸、环烯醚萜类，其中的绿原酸类是有机酸的主要有效成分，具有广泛的抗氧化、抗菌作用

。现已有研究发现天然药物黄柏、肉桂、丁香的提取物对变异链球菌都有抑制作用

，但目前国内外关于金银花与变异链球菌致龋性研究较少。

本实验采用光密度的值来表示待检样品中细菌的浓度，测得MIC 为12.5 mg/mL。在生长实验中，药液组细菌与标准株生长趋势基本一致，但OD

值均低于菌液组，说明金银花可能会影响细菌的增殖速度，但并不影响其生长的基本趋势。从产酸曲线上看，加入药液后pH 值随着药物浓度的增加而升高，产酸的抑制作用增强，说明金银花能抑制变异链球菌的产酸能力。

细菌的黏附能力是牙菌斑生物膜形成的基础，变异链球菌具有多种高亲和力的表面黏附素，这导致其即使没有蔗糖也能定植

。它表面与黏附有关的结构有黏附蛋白、胞外多糖等。变异链球菌表面的表面蛋白P1 目前被研究较多，10 个以上的蛋白P1 与唾液GP340 相互作用导致黏附作用的产生

。本研究发现随着金银花浓度增加，细菌黏附率呈下降趋势，且黏附抑制率上升，说明金银花能抑制其黏附。但目前抑制黏附的具体机制尚不清楚，有待进一步研究。

生物膜的特殊条件可以保护微生物免受宿主免疫细胞和药物治疗，并使微环境在低pH 时稳定，导致牙釉质脱矿

。牙菌斑生物膜基质的主要成分有变异链球菌分泌的胞外多糖，其能促进细菌在牙面的定植，起到生物膜骨架的作用，稳定菌斑基本结构。本实验测量OD

值以胞外多糖的量来间接衡量被膜的生成量，结果显示: 与菌液组相比，金银花药液培养24 h 后的OD

值呈减少趋势。另外在体外建立变异链球菌生物膜模型，再利用光学显微镜初步观察生物膜形成后的样貌，同时利用SEM 观察细菌数量变化，结果显示加入10 mg/mL 金银花药液组在3 个时段均降低了细菌的数目，同时减缓了生物膜的形成速度，初步证实金银花能抑制生物膜的形成。

即将播出的节目当中可能会存在画面损坏、音频损坏等问题，这就需要使用到播前审检技术，对素材进行检测，及时发现素材当中存在的损坏，并利用冗余备份技术及时播出相关的节目，保证播放系统的安全。

3.2.2 患者及照顾者缺乏协调经验 患者及照顾者在安排预约、完成专科护理以及安排交通工具前往预约地点等方面，有不同程度的困难。有研究结果显示，尽管APN给予帮助，但患者在出院后约1周仍存在交通方面问题，最后导致后期和医生预约失败[17]。此外，一些患者及家庭照顾者最终拒绝APN协调，其中部分患者和家庭照顾者向APN报告会自行做出必要的安排，但未能如期执行。部分家庭照顾者允许APN陪同患者去医院就诊，但家庭照顾者并未与医院协调好，故导致患者治疗并不理想。此外，主要家庭照顾者未能及时参加APN TOC模式，APN从其他照顾者获取信息有很大出入，也干扰了APN进一步干预。

综上所述，金银花可抑制变异链球菌的生长、产酸、黏附、生物膜形成。本次研究初步证实了金银花的抑菌作用，为龋病的防治提供了一定的实验依据。但目前关于金银花抗菌作用机制多停留在药理指标，化学成分与药理作用的关系仍未探索，且缺少对变异链球菌黏附相关蛋白、基因及动物模型的研究，因此，未来将从这些方面进一步深入研究。

Zeng HQ performed the experiments and wrote the article. Mao L collected the data. Jin YH assisted with the data statistics. Li ST assisted in the experimental design. Xu A designed the experiments and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

[1] Mathur VP, Dhillon JK. Dental caries: a disease which needs attention[J]. Indian J Pediatr, 2018, 85(3): 202-206. doi: 10.1007/s12098-017-2381-6.

[2] Kor M, Pouramir M, Khafri S, et al. Association between dental caries, obesity and salivary alpha amylase in adolescent girls of babol city, Iran-2017[J].J Dent (Shiraz), 2021, 22(1): 27-32. doi:10.30476/DENTJODS.2020.84190.1070

[3] Arora G,Humphris G,Lahti S,et al.Depression,drugs and dental anxiety in prisons: a mediation model explaining dental decay experience[J]. Community Dent Oral Epidemiol, 2020, 48(3): 248-255.doi:10.1111/cdoe.12522.

[4] Aurlene N, Manipal S, Prabu D, et al. Prevalence of oral mucosal lesions,dental caries,and periodontal disease among patients with systemic lupus erythematosus in a teaching hospital in Chennai,Tamil Nadu[J]. J Family Med Prim Care, 2020, 9(7): 3374-3380.doi:10.4103/jfmpc.jfmpc_1263_19.

[5] Li YQ,Kong DX,Bai M,et al.Lonicera japonica correlation of the temporal and spatial expression patterns of HQT with the biosynthesis and accumulation of chlorogenic acid in flowers[J]. Hortic Res,2019,6:73.doi:10.1038/s41438-019-0154-2

[6] Guo XY, Yu X, Zheng BQ, et al. Lonicerae japonicae network pharmacology-based identification of potential targets of flos acting on anti-inflammatory effects.[J] .Biomed Res Int, 2021, 2021:5507003.doi:10.1155/2021/5507003

[7] Zhou L, Wang H, Yi J, et al. Anti-tumor properties of anthocyanins from Lonicera caerulea 'Beilei' fruit on human hepatocellular carcinoma:

and

study[J]. Biomed Pharmacother,2018,104(104):520-529.doi:10.1016/j.biopha.2018.05.057.

[8] Wan HQ，Ge LL，Xiao LY，et al. 3,4,5-Tri-O-caffeoylquinic acid methyl ester isolated from Lonicera japonica Thunb. Flower buds facilitates hepatitis B virus replication in HepG2. 2. 15 cells [J].Food Chem Toxicol，2020，138：111250. doi: 10.1016/j.fct.2020.111250.

[9] 王桂林,徐未芳,刘乐,等.金银花不同溶剂提取物多酚含量及抗氧化活性[J]. 食品研究与开发, 2020, 41(5): 104-107. doi:10.12161/j.issn.1005-6521.2020.05.017.Wang GL,Xu WF,Liu Le,et al.The content and antioxidant activities of honeysuckle polyphenol extracted by different solvent[J].Food Res and Dev,2020,41(5):104-107.doi:10.12161/j.issn.1005-6521.2020.05.017.

[10] Golubev D, Zemskaya N, Shevchenko O, et al. Honeysuckle extract (Lonicera pallasii L.) exerts antioxidant properties and extends the lifespan and healthspan of drosophila melanogaster[J].Biogerontology,2022.doi:10.1007/s10522-022-09954-1

[11] Buko V, Zavodnik I, Budryn G, et al. Chlorogenic acid protects against advanced alcoholic steatohepatitis in rats via modulation of redox homeostasis, inflammation, and lipogenesis[J]. Nutrients,2021,13(11):4155.doi:10.3390/nu13114155.

[12] Ye D,Sun J,Li Y.Evaluation of toxicity,bacteriostatic,analgesic,anti-inflammatory,and antipyretic activities of Huangqin-Honghua-Pugongying-Jinyinhua extract[J]. Vet Sci, 2021, 8(12): 330. doi:10.3390/vetsci8120330.

[13] He ZY,Huang ZW,Jiang W,et al.

antimicrobial activity of cinnamal dehyde on biofilms.[J]. Front Microbiol,2019,10:2241.doi:10.3389/fmicb.2019.02241.

[14] Martins ML,Leite K,Pacheco-Filho EF,et al.Efficacy of red propolis hydro-alcoholic extract in controlling

biofilm build-up and dental enamel demineralization[J].Arch Oral Biol,2018,93(93):56-65.doi:10.1016/j.archoralbio.2018.05.017.

[15] Sá-Pinto AC, Rego TM, Marques LS, et al. Correction to: association between malocclusion and dental caries in adolescents: a systematic review and meta-analysis[J]. Eur Arch Paediatr Dent,2021,22(2):309.doi:10.1007/s40368-020-00595-x.

[16] Fan Z,Li L,Bai X,et al.Extraction optimization,antioxidant activity, and tyrosinase inhibitory capacity of polyphenols from Lonicera japonica[J]. Food Sci Nutr, 2019, 7(5): 1786-1794. doi:10.1002/fsn3.1021.

[17] Tsujii T,Kawada-Matsuo M,Migita H,et al.Antibacterial activity of phellodendron bark against

[J]. Microbiol Immunol,2020,64(6):424-434.doi:10.1111/1348-0421.12787.

[18] Cui C, Xu H, Yang H, et al. Antibacterial activity of fruiting body extracts from Culinary-Medicinal winter mushroom,flammulina velutipes(agaricomycetes)against oral pathogen

[J]. Int J Med Mushrooms, 2020, 22(2): 115-124. doi: 10.1615/IntJMedMushrooms.2020033335.

[19] Lemos JA, Palmer SR, Zeng L, et al. The biology of

[J]. Microbiol Spectr, 2019, 7(1): 10. doi: 10.1128/microbiolspec.GPP3-0051-2018.

[20] Sulan RM,Li JK,Crowley PJ,et al.Binding forces of

P1 adhesion[J]. ACS Nano, 2015, 9(2): 1448-1460. doi:10.1021/nn5058886.

[21] Bernardi S, Bianchi S, Botticelli G, et al. Scanning electron microscopy and microbiological approaches for the evaluation of salivary microorganisms behaviour on anatase titanium surfaces:in vitro study[J].Morphologie,2018,102(336):1-6.doi:10.1016/j.morpho.2017.12.001.