冻干猪胆粉的HPLC指纹图谱和含量测定方法的研究

王进吉 邹琼 张磊 伍晓萍 陈彤

摘要：筛选HPLC色谱条件，用于冻干猪胆粉的HPLC指纹图谱测定及冻干猪胆粉中牛磺猪去氧胆酸含量的测定，并与5批非冻干技术制备的市售猪胆粉进行对比。应用Shim-pack GIST-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.03 mol·L-1磷酸二氢钠溶液（磷酸调节pH=4.3）为流动相，梯度洗脱（0.01～20.00 min，29%～40%A;20.01～30.00 min，29%～29%A），流速1.0 mL·min-1，柱温30℃，检测波长200 nm。采用上述色谱条件测定10批冻干猪胆粉，通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”建立冻干猪胆粉对照指纹图谱，确定11个共有峰，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，规定5分钟后的色谱峰相似度不得低于0.95。10批冻干猪胆粉的指纹图谱相似度均大于0.995;5批市售猪胆粉中只有1批的相似度大于0.95。10批冻干猪胆粉中牛磺猪去氧胆酸的平均含量为5.56%±6.33%，5批市售猪胆粉中牛磺猪去氧胆酸的平均含量为0.99%±132.32%，仅有一批符合规定。冷冻干燥法制备的猪胆粉质量优于5批市售产品，冻干技术可用于生产优质猪胆粉。

关键词：冻干猪胆粉;HPLC-UV法;指纹图谱;牛磺猪去氧胆酸;含量测定

中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2022）04-0064-06

《中国药典》2000年版一部开始收载猪胆粉，之后的历版药典也均有收载[1]。2020年版《中国药典》记载猪胆粉味苦，性寒，归属肝、胆、肺、大肠经;有清热润燥，止咳平喘，解毒的功效，主要用于顿咳，哮喘，热病燥渴，目赤，喉痹，黄疸，泄泻，痢疾，便秘，痈疮肿毒的治疗[2]。现代药理学表明猪胆汁有镇咳[3]、抗炎[4]、抑菌[5]、利胆、抗过敏[6]、抗肿瘤[7]等药理作用，临床上用于百日咳[8]、肝炎[9]、阴道炎[10]、肝内胆管结石[11]、肠梗阻[12]等的治疗。2020年版《中国药典》中猪胆粉的制法为取猪胆汁，滤过，干燥，粉碎，即得[2]。其“含量测定”项下规定，按干燥品计算，含牛磺猪去氧胆酸（taurohyodeoxycholic acid，1）不得少于2.0%。指纹图谱是当今国际公认控制中药质量的质控方法，主要用于中药材加工、炮制等过程中的质控[13]。

本课题组检测市售猪胆粉，发现不同厂家的各批猪胆粉质量差异大，且猪胆粉中含有胆红素等热敏成分。因此，本论文拟对本课题组所制备的冻干猪胆粉建立HPLC指纹图谱，并对其含量进行测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC-20A高效液相色谱仪（含DGU-20A真空在线脱气机，LC-20AT四元泵，CTO-20A柱温箱，SPD-M20A检测器）

1.2 试药 对照品1（中国药品生物制品检定所，含量以96.8%计，批号：111943-201802），牛磺鹅去氧胆酸（2，中国药品生物制品检定所，批號：110846-2010007），甘氨猪去氧胆酸（3，成都德斯特生物技术有限公司，含量：97%，批号：DST191022-136）甘氨鹅去氧胆酸（4，成都德斯特生物技术有限公司，含量：98%，批号：DSTDG017601）。猪胆购自云南省昆明市呈贡区鸿腾生猪定点屠宰场，市售5批猪胆粉分别购于昆明中药材批发市场、上海红花药业、安徽亳州千草堂中药材批发市场、陕西天玺尚品商贸有限公司、西安通泽生物科技有限公司。乙腈、甲醇为色谱纯，磷酸二氢钠为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Shim-pack GIST-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相乙腈（A）-0.03 mol·L-1磷酸二氢钠溶液（磷酸调pH=4.3）（B），梯度洗脱（0.01～20.00 min，29%～40%A;20.01～30.00 min，29%～29%A）;流速1.0 mL·min-1;柱温30℃;检测波长200 nm;进样量5 μL。

2.2 对照品溶液的制备 分别取1～4号对照品约2.5 mg，精密称定，分别置5 mL的量瓶中，加甲醇溶解，定容。精密移取各上述4种母液1 mL置同一个5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，0.22 um滤膜滤过，取续滤液，即得混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 冻干猪胆粉供试品溶液的制备 取冻干猪胆粉末约0.5 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加入甲醇20 mL，超声处理20 min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，0.22 um滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3.2 市售猪胆粉供试品溶液的制备 取市售猪胆粉约0.5 g，精密称定，按照“2.4.1”进行制备，即得。

2.4 冻干猪胆粉HPLC指纹图谱

2.4.1 精密度、重复性、稳定性试验 取冻干猪胆粉供试品溶液按上述色谱条件下进样，分析测定连续进样6次，以3（峰7）为参照峰（S），计算各共有峰相对保留时间的RSD<0.1%，相对峰面积RSD<3.5%（n=6），表明仪器精密度良好。

取同批号冻干猪胆粉6份，按2.4.1项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析测定，以3（峰7）为参照峰（S），计算各共有峰相对保留时间的RSD<0.1%，相对峰面积RSD<3.6%（n=6），表明本试验方法重复性良好。

取供试品溶液分别在0、4、8、12、24、36h，按上述色谱条件下进行分析检测，以3（峰7）为参照峰（S），计算各共有峰相对保留时间的RSD<0.41%，相对峰面积RSD<4.8%（n=6），说明供试品溶液在36 h内稳定。

2.4.2 指纹图谱的建立及共有峰的标定 分别取对照品1至4号按对照品适量，精密称定，制成混合标准溶液。10批自制冻干猪胆粉按供试品溶液制备，在上述色谱条件下进样。通过对照品保留时间分别标定1（峰5）、3（峰7）、2（峰10）、4（峰11）。将各批供试品的色谱图以AIA格式导入中国药典推荐中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版），剪切前5 min溶剂峰，选定S1为参照图谱，时间窗宽度为0.1，中位数法进行多点校正生成对照图谱R，10批自制冻干猪胆粉供试品溶液确定11个色谱峰为共有峰。

2.4.3 指纹图谱相似度评价 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行数据（2012版）”处理，以系统生成的参照图谱为对照图谱，计算10批冻干猪胆粉的相似度，结果见表1，数据表明10批冻干猪胆粉相似度均大于0.98。选峰面积最大3标记为S峰，计算其他共有峰的相对保留时间、相对峰面积，结果分别见表2、表3。

2.4.4 市售猪胆粉的相似度评价 5批市售猪胆粉按供试品溶液制备，在上述色谱条件下进行测定。将5批供试品的色谱图以AIA格式导入中国药典推荐中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版），剪切前5 min溶剂峰，选定上述10批冻干猪胆粉生成的对照图谱R为参照图图谱，时间窗宽度为0.1，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行数据处理，计算相似度，结果见表4，5批市售猪胆粉的指纹图谱仅有1批相似度大于0.95，其余4批均不符合规定。

2.5 冻干猪胆粉和市售猪胆粉含量测定

2.5.1 标准曲线的制备 分别配制浓度为0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1 mg·mL-1的1溶液，在含量测定项下色谱条件进样分析。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，1的标准曲线方程为Y=2×106X-1550.1，r=1。

2.5.2 精密度、重复性、稳定性试验 取冻干猪胆粉供试品溶液按上述色谱条件下进行分析测定连续进样6次，1峰面积RSD<0.3%（n=6），表明仪器精密度良好。

取同批号冻干猪胆粉6份，按供试品溶液制备，在上述色谱条件下进行分析测定，1峰面积RSD<1.3%（n=6），表明本试验方法重复性良好。

取冻干猪胆粉供试品溶液别在0、1、2、4、8、12、24、36 h，按上述色谱条件下进行分析检测，36 h内1峰面积RSD<1.0%（n=8）。说明供试品溶液在36 h内稳定。

2.5.3 加样回收试验 精密称取冻干猪胆粉适量，按供试品溶液进行制备，制成5 mg·mL-1冻干猪胆粉溶液。精密称取1对照品适量，加甲醇制成0.26 mg·mL-1的1溶液，取冻干猪胆粉溶液、1溶液各1 mL置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀取适量过0.22 um微孔滤膜，按“2.2”项下色谱条件进行分析，结果显示平均回收率为101.47%，RSD（n=6）为0.68%。

2.5.4 样品含量测定 取上述10批冻干猪胆粉和5批市售猪胆粉按供试品溶液，在上述色谱条件下进行含量测定，10批冻干猪胆粉中1的平均含量为（5.56±6.33）%，5批市售猪胆粉中1的平均含量为（0.99±132.32）%，仅1批符合规定。

3 讨论

指纹图谱的色谱条件的建立：分别按《中国药典》2020年版第一部猪胆粉含量测定项下甲醇-0.03 mol·L-1磷酸二氢钠溶液（70∶30）（用磷酸调节pH值为4.4）和文献[15]乙腈-0.03 mol·L-1磷酸二氢钠（磷酸调pH4.4）梯度洗脱（0.01～40.00 min：28%～36%乙腈;40.01～50 min：28%～28%乙腈）两个流动相系统，发现文献[15]梯度洗脱的图谱出峰较多，峰形好，分离度较佳，仅存在少部分峰重叠的问题。进一步考相缓冲盐溶液的pH值、柱温、进样量和梯度洗脱条件，筛选出最佳方案，即以乙腈-0.03 mol·L-1磷酸二氢钠溶液（磷酸调节pH4.3）为流动相，梯度洗脱（0.01～40 min：乙腈29%～40%;20.01～30 min：29%～29%），能分離出11个冻干猪胆粉色谱峰，较文献[15]的色谱条件多分离出4个峰，且测定时间短。

在本色谱条件下利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统建了由11个共有峰组成的冻干猪胆粉指纹图谱，10批冻干猪胆粉样品的指纹图谱相似度高于0.995，规定5分钟后的色谱峰相似度不得低于0.95，10冻干猪胆粉样品的指纹图谱均符合规定;5批市售猪胆粉的指纹图谱仅有1相似度符合规定。

在本色谱条件下测定1的含量，10批冻干猪胆粉1的平均含量为5.56%±6.33%，均符合药典标准;而市售猪胆粉5批中仅有1批符合规定。

4 结论

采用冷冻干燥技术成功制得冻干猪胆粉，得到的冻干猪胆粉颜色鲜黄、洁净。筛选的色谱条件可作为冻干猪胆粉和猪胆粉指纹图谱和含量测定的色谱条件，用于测定的冻干猪胆粉和市售猪胆粉。5批市售猪胆粉只有1批的指纹图谱相似度和含量测定结果符合规定，还需进一步购买和测定市售猪胆粉的质量，找出市售猪胆粉质量不符合规定的原因。

综上，冻干技术可用于生产优质猪胆粉，可作为制备猪胆粉的新技术。

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（收稿日期：2022-01-26）