HPLC法同时测定古代经典名方复方制剂蠲痹颗粒3种成份的研究*

李娜，陈晓艺△，黄小童，李清平

（1.广西中医药大学制药厂，南宁 530023；2.广西壮瑶药工程技术研究中心，南宁 530200）

壮瑶药方蠲痹颗粒祛风除湿、止痛，主治风寒湿三气合而成痹者。蠲痹颗粒处方出自清代程国彭《医学心悟》蠲痹汤，因临床用于防治类风湿性关节炎，疗效确切，获批为国家古代经典名方类新药，医学前景良好[1-2]。组方由羌活、独活、桂心、秦艽、当归、川芎等组成。目前关于蠲痹颗粒制剂质量控制方面少有研究，为使制剂质量得到有效控制，本研究建立HPLC法测定蠲痹颗粒中绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸3种指标性成分含量的方法，为蠲痹颗粒质量标准制定提供参考。

1 仪器与试药

1.1主要仪器 美国Waters-e2695高效液相色谱仪（包括四元高压泵系统、自动进样器、二极管阵列检测器和柱温箱等）；BT125D电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；XS205电子天平（梅特勒-托利多）；超声清洗器（SG250HE，上海冠特超声仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（HH-4，常州奥华仪器有限公司）；超纯水用密思博超纯水机制备。

1.2试药 蠲痹颗粒样品由广西中医药大学制药厂自制（生产批号为20201201、20201202、20201203、20201204、20201205、20210101、20210102、20210103、20210104、20210105）。对照品：绿原酸（chlorogenic acid，B20782，含量98%），上海源叶生物科技有限公司；龙胆苦苷（gentiopicroside，供含量测定用，190513，含量98%）和阿魏酸（ferulic acid，供含量测定用，110773-201614，含量99%），中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯），Fisher公司；甲酸（分析纯），天津市大茂化学试剂厂；甲醇（分析纯），西陇科学有限公司；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱为Agilent ZORBAX SBC18（250 mm×4.6 mm,5μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（5 min，5%A；5～20 min，5%～12% A；20～40 min，12%～20% A；50～65 min，20～90%A；65～80 min，90%A）；检测波长：龙胆苦苷277 nm，绿原酸、阿魏酸320 nm；流速为1 mL/min；柱温30℃；进样量10μL。

2.2混合对照品溶液的制备 精密称取绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸对照品适量，加甲醇溶解，分别制成浓度为0.984 9 mg/mL、0.991 76 mg/mL及1.002 87 mg/mL的对照品储备液。另取上述溶液适量，置于同一量瓶中，加甲醇稀释，制成含绿原酸、龙胆苦苷及阿魏酸浓度分别为0.295 5 mg/mL、1.487 6 mg/mL、0.200 6 mg/mL的混合对照品溶液，置于冰箱贮存，备用。

2.3供试品溶液制备 取蠲痹颗粒约2 g，精密称定，加入0.1%甲酸甲醇溶液定容至25 mL，超声提取40 min，补足减失的重量，滤过，取续滤液过0.22μm微孔滤膜，备用。

2.4阴性样品溶液制备 按蠲痹颗粒的处方比例及制备工艺要求配制缺当归、羌活、独活；阴性样品及缺秦艽阴性样品，按照“2.3项”下方法制成相应的阴性溶液。

2.5系统适用性试验 按“2.1项”下色谱条件分别测定对照品、供试品及阴性溶液，实验结果显示：（320 nm）目标物质绿原酸、阿魏酸和（277 nm）目标物质龙胆苦苷分别在320 nm和277 nm相应的对照品色谱与供试品色谱中相同的保留时间处都有色谱峰，并且分离度均大于1.5、理论塔板数均大于5 000，拖尾因子均在0.95～1.05。说明该色谱条件适用于蠲痹颗粒中绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸这3个成分的测定，见图1、图2。

图1 蠲痹颗粒HPLC色谱图（277 nm）

图2 蠲痹颗粒HPLC色谱图（320 nm）

2.6线性范围考察 取“2.2项”下制备的混合对照品溶液，配置成一系列浓度的对照品溶液注入高效液相色谱仪，按“2.1项”下色谱条件进行测定，测定峰面积，以进样量（μg）为横坐标（X），相应峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得到回归方程，见表1。

表1 回归方程及线性范围

2.7精密度试验 取绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸混合对照品溶液，按“2.1项”下色谱条件测定，连续进样6次，分别测定绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸的峰面积，计算日内精密度的RSD值分别为0.44%、0.20%、0.15%，和日间精密度的RSD值分别为0.25%、0.55%、0.71%，结果表明精密度良好。

2.8稳定性试验 取蠲痹颗粒（批号20201201）2.0 g，按“2.3项”下供试品溶液制备方法制备一份供试品溶液，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h，按“2.1项”下色谱条件依次测定绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸的峰面积，计算平均含量分别为0.358 3 mg/g、19.660 1 mg/g、2.265 0 mg/g，RSD值分别为0.11%、0.21%、0.19%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.9重复性试验 取蠲痹颗粒（批号20201201）2.0 g 6份，精密称定，按“2.3项”下方法制得供试品溶液6份，按“2.1项”下色谱条件测定，结果6份试样中绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸平均含量分别：0.359 9 mg/g、19.320 5 mg/g、2.246 4 mg/g，RSD值分别为0.50%、0.65%、0.44%，结果表明该方法的重复性良好。

2.10加样回收率试验 取蠲痹颗粒（批号20201201）（绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸平均含量分别为0.359 9 mg/g、19.320 5 mg/g、2.246 4 mg/g）1.0 g，精密称定6份，分别精密加入绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸对照品各0.295 0 mg、18.843 4 mg、2.005 7 mg。按“2.3项”下供试品溶液制备方法制备溶液，按“2.1项”下色谱条件测定各峰面积，计算绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸各加样回收率分别为101.4%、97.2%、100.0%，RSD值分别为2.4%、2.7%、2.7%。实验结果表明方法准确度良好，见表2。

表2 加样回收率试验的结果 n=6

2.11样品测定取10批蠲痹颗粒，各约2 g，精密称定，按“2.3项”下制备方法制备供试品溶液，按“2.1项”下色谱条件测定，每批测定2次，计算绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸的含量，见表3。

表3 样品含量测定结果

3 讨论

3.1质量评价指标的选择“蠲痹汤”为治疗类风湿性关节炎的经典名方，临床治疗类风湿性关节炎疗效确切，蠲痹颗粒根据国家药品注册法规要求将蠲痹汤开发成经典名方类中药新药。组方由羌活、独活、桂心、秦艽、当归、川芎、甘草、海风藤、桑枝、乳香、木香组成。方中的药材中均含有多种有机酸[3-5]、酚酸[6-7]及环烯醚萜苷[8]类成分，且环烯醚萜苷[9]和有机酸、酚酸[10]为其抗风湿功效的有效成分。当归、羌活、桑枝、独活均含有绿原酸，秦艽[11]含有龙胆苦苷，当归、独活、川芎均含有阿魏酸，据文献记载绿原酸[12]、龙胆苦苷[13]、阿魏酸[14]均有一定的抗炎、抗风湿作用，为本品的主要活性成分。因此本研究选择绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸作为质量控制的评价指标。

3.2提取方法的选择 以绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸的含量为评价指标，对提取方式（超声提取法和回流提取法）、提取时间（20 min、30 min、40 min）、溶剂用量（1∶10、1∶25、1∶50）、提取溶剂[磷酸-甲醇（1∶100）、甲酸-甲醇（1∶100）、水、甲醇、70%甲醇]方面进行比较，结果显示，以25 mL甲酸-甲醇（1∶100）、超声40 min所得供试品溶液中绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸3种成分总含量最高，且方法简单可行。

3.3检测波长的选择 本实验发现，绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸的最大吸收波长差异较大，在320 nm处，绿原酸、阿魏酸峰各项指标较好，在277 nm处，龙胆苦苷峰各项指标较好。为使各成分均能较好地检出，故选择320 nm为绿原酸、阿魏酸的检测波长，277 nm为龙胆苦苷的检测波长。

3.4流动相的选择 流动相组分选择了以下几组进行考察：（1）甲醇-0.1%甲酸水溶液；（2）乙腈-0.1%甲酸水溶液；（3）乙腈-水；（4）甲醇-水。采用等度、梯度洗脱两种洗脱方式进行洗脱，结果显示采用乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱，可使各目标成分达到较好分离，且峰形较好。

3.5柱温考察 本研究分别考察了25℃、30℃、35℃3个柱温下目标物质的分离效果，结果显示，柱温30℃时绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸3个成分的分离度及对称因子均符合规定。

综上所述，绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸3个成分含量测定方法专属性强，重现性、稳定性均较好，方法简便，可更好地控制蠲痹颗粒内在质量，可作为本品的质量控制的方法。