汉防己甲素纳米晶的制备及质量评价*

黄文秀，周先果，黄锦平，冯丽珍，吕玉莲，邓婉瑶，刘胜君，王瑶，黄兴振△

（1.广西医科大学药学院，南宁 530021 ；2.广西壮族自治区肿瘤防治研究所，南宁 530021）

粉防己碱（Tetrandrine，Tet）是从防己科千金藤属植物汉防己干燥块根中提取的一种双苄基异喹啉生物碱，具有抗纤维化、降低门静脉压力、消炎、镇痛等作用[1]。但Tet作为一种生物碱，其水溶性差，导致生物利用度低，药效的发挥及临床应用均受到了极大的限制。目前已有通过制备纳米粒[2]、脂质体[3]等新剂型来提高Tet的溶解性，但仍存在载药量少、包封率低等问题。

纳米晶体药物无需载体材料，是将纯药物形成亚微米颗粒的胶状分散体系，不受包封率的制约，药物剂量可调范围宽，依靠电荷保护剂和立体保护剂维持制剂的稳定[4]。作为一种新的制剂技术，纳米晶体药物能够提高低溶解度药物的口服生物利用度[5]，也可用于静脉注射或肺部给药[6]。本研究采用超声法制备防己甲素纳米晶（Tet-NCs），并对纳米晶的粒径、晶型等进行质量评价，为Tet-NCs的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1仪器JY92-IIDN超声波细胞粉碎机（900 W），宁波新芝生物科技股份有限公司；Nano ZSMPT-2纳米粒度电位仪，英国Malvern公司；B13-3型智能恒温定时磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司；Smartlab 9kw型X射线衍射仪,日本理学RIGAKU公司；DSC1型差示热扫描仪，梅特勒公司；SU8100型扫描电子显微镜，日本日立公司。

1.2药品和试剂Tet（南京景竹生物科技有限公司，含量＞98%，批号：JZ20110401）；羟丙基甲基纤维素（HPMC，上海麦克林生化科技有限公司，批号：C11847616）；大豆磷脂（上海太伟药业股份有限公司）；吐温80（国药集团化学试剂有限公司，批号：20200309）；泊洛沙姆68（上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10263859）；泊洛沙姆188（上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10751103）；蛋黄卵磷脂（合肥博美生物科技有限责任公司，批号：RUIBIO P4378）；甘露醇（上海瑞永生物科技有限公司，批号：RT21U1124）；蔗糖（天津光复精细化工有限公司，批号：20180313）。

1.3 Tet-NCs混悬液的制备方法筛选 精密称取Tet 10 mg，溶解于1 mL甲醇（作为有机相）；称取0.1 g吐温80和0.1 g大豆磷脂，加至20 mL去离子水中溶解（作为水相）；水相置于冰浴中，将有机相一次性加至水相中。然后分别按照以下方法制备Tet-NCs混悬液：（1）超声法[7]：超声10 min（功率300 W），即得Tet-NCs混悬液；（2）搅拌法[8]：搅拌10 min（速度为1 200 r/min），即得Tet-NCs混悬液；（3）超声—高压均质法[9]：超声10 min（功率300 W），得到Tet-NCs粗混悬液，将Tet-NCs置于高压均质机，在200 Pa压力下循环10次，然后在300 Pa压力下循环20次，即得Tet-NCs混悬液。

将上述3种方法制备的Tet-NCs进行粒径的检测，并观察其外观，根据外观、粒径、PDI确定最佳的制备方法。

1.4最佳方法制得的Tet-NCs的影响因素考察

以平均粒径、多分散系数（PDI）等为指标，分别对Tet-NCs制备过程中的稳定剂类型、Tet浓度、有机相与水相的体积比等6个影响因素进行考察。

1.5稳定系数（SI）和再分散指数（RDI）测定 取适量Tet-NCs混悬液，3 000 r/min离心30 min，取未沉淀部分测定粒径，重复3次，计算SI[10]，SI＝离心后未沉淀部分的平均粒径/离心前的平均粒径。SI越接近1，表明纳米混悬剂稳定性越好。以RDI作为Tet-NCs冻干后再分散性的评价指标之一[11]，RDI＝冻干再分散后测得的粒径/初始粒径。RDI越接近1，表明冻干后“固化损伤”越小。

1.6冻干保护剂的筛选 按“1.3项”下制备Tet-NCs，分别加入5%蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇以及2.5%甘露醇+2.5%葡萄糖、2.5%甘露醇+2.5%葡萄糖、2.5%甘露醇+2.5%乳糖作为冻干保护剂[12]，以平均粒径、PDI、RDI及外观作为评价指标，考察不同的冻干保护剂对于Tet-NCs的影响。

1.7 Box-Behnken响应面法优化制备工艺 基于单因素的考察结果，选择并考察对制备Tet-NCs影响较大的3个因素对Tet-NCs制备工艺的影响，以粒径作为响应值，运用Design Expert 13软件进行3因素3水平的试验设计[13-15]。

1.8 Tet-NCs质量评价（1）扫描电子显微镜（SEM）观察形态：取Tet原料药和Tet-NCs适量，均匀黏附在样品池上，表面减压喷金处理，于SEM下观察形态。（2）X射线衍射和DSC检测：将Tet原料药、物理混合物和Tet-NCs冻干粉分别加入带有凹槽的定性分析用塑料玻璃板材中，用毛玻璃压实。扫描参数：铜钯，k线，扫描范围（2θ）30°～60°，管压40 kV，管流200 mA，扫描波长1.540 56 a，扫描速度：2°/min[2]。分别取5 mg Tet原料药，物理混合物及Tet-NCs冻干粉，进行DSC分析。设置气体为氮气，扫描温度范围为30～270℃，升温速率为10℃/min，气体流速为50 mL/min[2]。

1.9 Tet-NCs溶出度测定（1）色谱条件：流动相为0.06%二乙胺甲醇∶水（60∶40），色谱柱C18（250 mm×4.5 mm，5µm），检测波长257 nm，柱温30℃，流速1 mL/min，进样量10µL[16]。（2）标准曲线：精密称取20 mg Tet对照品置于10 mL容量瓶中，加入适量甲醇超声溶解，甲醇定容至刻度，即得对照品溶液（2 mg/mL）；精密吸取对照品溶液适量，用甲醇稀释浓度为0.02～0.1 mg/mL对照品溶液，在上述色谱条件下进样分析，以药物浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

参考2020年版《中国药典》（第四部）中溶出度测定（桨法）[17]，进行溶出度实验。取Tet原料药10 mg溶解于1 mL甲醇中，再取20 mL Tet-NCs混悬液（相当于含Tet约10 mg），各3份，设置溶出介质为900 mL pH为7.4的缓冲溶液、水温（37±0.5）℃、转速100 r/min。于投样后不同时间取样2 mL，取样后迅速补足2 mL pH为7.4的缓冲溶液。取样溶液用0.05µm滤膜过滤，取续滤液，按上述色谱条件进行进样分析，记录峰面积，根据标准曲线法计算Tet的浓度，计算累积溶出度，并绘制Tet累积溶出度—时间曲线。

2 结果

2.1不同制备方法对Tet-NCs粒径、PDI和外观的影响 超声法制得的Tet-NCs粒径和PDI较小，搅拌法制得的Tet-NCs粒径较大，PDI较小，高压均质法制得的Tet-NCs粒径和PDI较小，见表1。

表1 不同制备方法对Tet-NCs粒径、PDI和外观的影响 ，n=3

表1 不同制备方法对Tet-NCs粒径、PDI和外观的影响 ，n=3

2.2不同稳定剂对Tet-NCs粒径、PDI和SI的影响

吴三大提出过“书法之源源于自然”的论断。实践中，他从凿石和弹棉花中感悟出书法的节奏和韵律，从观云卷云舒琢磨到字体的灵动和变化，从民族舞蹈中寻觅到字体的造型和变异。因此，他的作品极具节奏感和韵律感，从他落款的三大的“大”字，可以看出横平不平，捺划采用藏族舞蹈中“巴喳嗨”的动作造型，让书法呈现舞美感。

吐温80+大豆磷脂作为稳定剂时Tet-NCs粒径和PDI较小，SI为0.96；其他稳定剂粒径和PDI较大，SI不接近1.00，见表2。

表2 不同稳定剂对Tet-NCs粒径、PDI和SI的影响 ，n=3

表2 不同稳定剂对Tet-NCs粒径、PDI和SI的影响 ，n=3

2.3不同因素对Tet-NCs粒径和PDI的影响

（1）有机相与水相的比例为1∶10时粒径和PDI也较大，有机相与水相比例为1∶20以上时粒径和PDI变化幅度不大；（2）超声功率低于180 W时粒径和PDI相对较大，超声功率大于270 W时粒径和PDI变化幅度不大；（3）超声时间为1 min时粒径和PDI相对较大，超声时间长于5 min时粒径和PDI随时间的延长变化幅度不大；（4）吐温80的含量为0.5%时，大豆磷脂的含量增高时粒径变化幅度不大，PDI逐渐减小，随着吐温80的含量升高Tet-NCs的粒径逐渐减小，PDI变化不明显；（5）Tet浓度从7 mg/mL增至10 mg/mL时，Tet-NCs的粒径逐渐减小，PDI变化不明显，见表3。

表3 不同因素对Tet-NCs粒径和PDI的影响 ，n=3

表3 不同因素对Tet-NCs粒径和PDI的影响 ，n=3

2.4不同冻干保护剂对Tet-NCs粒径、PDI和RDI的影响 以蔗糖为保护剂的冻干粉，粒径、PDI和RDI最小，其他冻干保护剂，粒径、PDI和RDI较大，见表4。

表4 不同冻干保护剂对Tet-NCs粒径、PDI和RDI的影响 ，n=3

表4 不同冻干保护剂对Tet-NCs粒径、PDI和RDI的影响 ，n=3

2.5响应面结果 运用Design Expert 13软件进行多元线性回归，得回归方程为Y=90.81-2.64*X1-4.06*X2-19.27*X3-5.41*X1X2+2.35*X1X3-1.98*X2X3-0.852 3*X12-3.74*X22+0.420 3*X32（R2=0.886 6），对回归模型进行方差分析，因素水平见表5，试验设计与结果见表6，方差分析见表7。

表5 试验设计因素与水平

表6 实验设计与结果

表7 方差分析

通过响应面设计模型及回归方程计算，分析得出最佳工艺参数如下：超声功率为270 W，超声时间为8.44 min，吐温80的含量为0.1%，预测粒径为115.38 nm，综合本实验条件及设备多方面，最终调整工艺为：超声功率为270 W、超声时间为8 min、吐温80的含量为0.1%。在响应面筛选出的最佳处方及工艺的条件下，平行制备3批Tet-NCs见表8。

表8 3批Tet-NCs稳定性验证结果

2.6 Tet-NCs质量分析SEM显示：Tet原料药以大小不均匀，不规则结构存在，而Tet-NCs呈不规则椭圆形和圆形，粒度和大小分布较均匀，见图1。

图1 原料药（A）和Tet-NCs（B）的电镜图

2.7溶出度结果 标准曲线回归方程为Y=192.83X-194.96，R2=0.999 7。5 min以内Tet-NCs累积溶出度约为66.50%，而Tet原料药累积溶出度约为52.30%，Tet-NCs的累积溶出度较Tet原料药高约14%左右；120 min内Tet-NCs累积溶出度约为82.64%，而Tet原料药累积溶出度约为58.57%，Tet-NCs的累积溶出度较Tet原料药高约24%左右，见图2C。

图2 Tet-NCs的X射线衍射（A）和DSC（B）分析结果及溶出曲线（C）

3 讨论

本研究在进行Tet-NCs混悬液制备工艺考察时发现，吐温80+大豆磷脂作为稳定剂时，制得的纳米混悬剂粒径小，体系能保持长时间的稳定，其原因一可能是其他稳定剂临界胶束浓度高于吐温80+大豆磷脂，因此当稳定剂用量相同时，其他稳定剂未达到临界胶束浓度，使得产生纳米粒子表面无法完全被稳定剂包裹，从而粒径多大于吐温80+大豆磷脂；其原因二可能是吐温80+大豆磷脂在用量相同时，表面张力小于其他稳定剂，使得体系表现出更佳的稳定性。纳米晶的粒径随着吐温80含量升高粒径逐渐减小，PDI变化不明显，可能原因是稳定剂用量过多，超过其临界胶束浓度时，多余的稳定剂会形成胶束，与药物纳米粒竞争吸附稳定剂，使药物纳米晶的粒径减小。吐温80+大豆磷脂的SI越接近1，表明Tet-NCs稳定性越好，体系能保持长时间的稳定，其效果优于其他稳定剂。当大豆磷脂的含量低于0.4%时，静置数分钟后会析出沉淀，大豆磷脂为0.5%时，静置数分钟依旧澄清透明。综合以上结果，大豆磷脂的含量为0.5%较为合适。在一定的范围内，稳定剂的含量越低越好，吐温80的选择范围为0.1%～0.3%。

以蔗糖为保护剂的冻干粉，复溶速率快，并且粒径相对较小，PDI和RDI最小，并未发现明显的“固化损伤”，其他的冻干保护剂复溶后粒径增大比较明显，并且PDI和RDI也较大，出现了明显的“固化损伤”。

失拟项不显著，表明方程拟合度较好，模型具有极显著性差异，预测性高。R2=0.886 6，说明该模型与实际值拟合度良好，可以用该模型来分析和预测试验结果。回归方程的显著性表明，吐温80含量对结果影响显著，其余各项对结果影响不显著。此外，从方程中可以看出各因子对Tet-NCs的粒径大小影响顺序为吐温80含量（%）＞超声时间＞超声功率。平行制备3批Tet-NCs，预测值（115.38 nm）与实测值接近，表明该模型预测性良好，可信度高，可用于后期实验。

Tet原料药在8.44°、11.51°、14.14°、15.45°、19.62°、26.42°有较强的衍射峰出现，表明Tet原料药具有特定的晶体形态，物理混合物中Tet的特征峰基本得到保留，而Tet-NCs的XRD图谱中特征峰消失，呈现弥散的状态，表明Tet-NCs中Tet呈现无定型结构[13]。Tet原料药在219℃出现特征吸收峰，表明熔点在为219℃。物理混合物中出现了Tet特征吸收峰，但发生了偏移，可能是由于与辅料混合后引起的熔点变化，并且在185℃出现特征吸收峰，表明辅料熔点在为185℃。而Tet-NCs中Tet特征吸收峰减弱，可能由于在制备超声的过程中及冻干过程中导致Tet晶型发生了改变[13]。

综上所述，本研究成功优化了Tet-NCs的制备工艺，所制备的Tet-NCs质量也符合要求，可为进一步开发Tet-NCs提供参考，也为Tet-NCs的工业化提供技术支持。