HIF-1α、HIF-2α和GLUT-1在非霍奇金淋巴瘤中的表达及其临床意义*

张庭凤，蔡正文，孙蔚亮，梁 俐，甘廷庆，罗婕

（广西医科大学第二附属医院肿瘤内科，南宁 530007）

缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）和葡萄糖转运蛋白-1（glucose transporter-1，GLUT-1）在肿瘤细胞的生长和凋亡中起着重要的调控作用，与肿瘤的发生、转移和凋亡密切相关。在乏氧微环境中，HIF-1和GLUT-1表达上调，导致肿瘤对缺氧的适应。国内、外的相关研究显示，HIF-1α、HIF-2α和GLUT-1蛋白能够作为恶性肿瘤的早期预警指标以及肿瘤良、恶性的鉴别诊断指标，而对三者在非霍奇金淋巴瘤中表达情况的研究报道较少。淋巴瘤国际预后指数（international prognostic index，IPI）是非霍奇金淋巴瘤常用的预后判断指标，而HIF-1α、HIF-2α和GLUT-1的表达与IPI的关系尚未见报道。本研究旨在对HIF-1α、HIF-2α和GLUT-1在非霍奇金淋巴瘤中的表达情况以及与IPI的相关性进行分析，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017年3月至2021年3月广西医科大学第二附属医院收治的非霍奇金淋巴瘤和淋巴结增生患者的病理切片标本，均经病理诊断证实。非霍奇金淋巴瘤42例（淋巴瘤组），其中男25例，女17例；年龄20～69岁，中位年龄45岁。淋巴结增生37例（淋巴结增生组），其中男20例，女17例；年龄18～62岁，中位年龄34岁。

1.2 方法

1.2.1免疫组织化学法检测HIF-1α、HIF-2α和GLUT-1的表达 使用生物组织脱水机完成组织脱水、透明和浸蜡。组织包埋、4μm连续切片和烤片。常规切片脱蜡和抗原修复，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次，每次3 min。将配制好的3%过氧化氢滴加于切片组织上以阻断内源性过氧化物酶，室温孵育15 min，PBS冲洗3次。滴加稀释的山羊血清，室温封闭30 min，以减少非特异性染色。滴加稀释的一抗（HIF-1α 稀释比1∶200、HIF-2α 稀释比1∶400、GLUT-1稀释比1∶500），于4°C冰箱中孵育过夜。PBS冲洗切片3次，每次3 min，滴加酶标链霉亲和素标记的山羊抗兔/小鼠二抗（稀释比1∶1 000），37℃孵育30 min。PBS冲洗后每张切片滴加新鲜配制的二氨基联苯胺（DAB）显色液，显微镜下观察，阳性信号为棕黄色或棕褐色，用蒸馏水冲洗切片终止显色。用Harris苏木素复染2 min，水洗后用1%的盐酸酒精分化，再用PBS浸洗返蓝。然后将切片置于梯度乙醇中脱水，二甲苯中透明，中性树胶封片。以PBS液代替一抗作为阴性对照。晾干的切片在显微镜下观察，采集图像。

1.2.2结果判读 由两位具有副主任医师资格的病理学专家双盲阅片，根据染色强度和阳性细胞数评估HIF-1α、HIF-2α和GLUT-1表达情况。判断标准：（1）染色强度：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；（2）阳性细胞数≤10%为0分，11%～50%为1分，51%～79%为2分，≥80%为3分。阳性细胞数得分与染色强度得分相乘即为染色指数（staining index，SI），SI≥3视为阳性。

1.2.3 IPI评分 按年龄、分期、结外病变、体力分级（ECOG评分）、乳酸脱氢酶（LDH）5个指标（Shipp标准）进行IPI评分。本研究将IPI按0～2分（低危、低中危）和3～5分（高中危、高危）分为两组。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行数据分析，计数资料以百分率（%）表示，两组间比较采用χ2检验或Fisher精确概率检验，两指标间相关性分析采用列联系数，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HIF-1α、HIF-2α 及GLUT-1 蛋白在淋巴瘤和淋巴结增生中的表达

淋巴瘤组HIF-1α、HIF-2α及GLUT-1蛋白阳性表达率均高于淋巴结增生组（P＜0.01），见表1、图1。

图1 淋巴瘤和淋巴结增生HIF-1α、HIF-2α及GLUT-1免疫组化染色（SP法，×400）

表1 两组HIF-1α、HIF-2α及GLUT-1蛋白阳性表达率比较 n（%）

2.2 淋巴瘤组织中HIF-1α、HIF-2α及GLUT-1表达之间的相关性分析

淋巴瘤组织中HIF-1α的表达与HIF-2α、GLUT-1的表达呈正相关关系（r=0.593，P＜0.05；r=0.583，P＜0.05），HIF-2α 的表达与GLUT-1的表达呈正相关关系（r=0.331，P＜0.05）。

2.3 淋巴瘤不同IPI分组中HIF-1α、HIF-2α 及GLUT-1蛋白的阳性表达率比较

IPI 3～5分组HIF-1α、HIF-2α及GLUT-1蛋白阳性表达率均高于IPI 0～2分组（均P＜0.05），见表2。

表2 淋巴瘤不同IPI分组中HIF-1α、HIF-2α及GLUT-1蛋白的阳性表达比较 n（%）

2.4 淋巴瘤中HIF-1α、HIF-2α及GLUT-1表达与IPI评分相关性分析

HIF-1α、HIF-2α及GLUT-1的阳性表达与IPI评分均呈正相关关系（0＜r＜1，P＜0.05），HIF-1α、HIF-2α及GLUT-1阳性表达者IPI评分也较高，见表3。

表3 HIF-1α、HIF-2α和GLUT-1的表达与IPI评分的相关性

3 讨论

缺氧是许多恶性肿瘤的共同特征，肿瘤细胞对缺氧的适应性反应主要由HIF-1介导，HIF-1由HIF-1α、HIF-2α亚基与HIF-1β亚基共同构成，GLUT-1是HIF-1的靶基因，α亚基是HIF-1的氧调节亚基，β亚基是结构性亚基。常氧状态下，α 亚基通过泛素化途径被降解；而在低氧条件下，HIF-1α、HIF-2α降解被抑制，引起这两者聚集，并与β亚基组成异二聚体发生适形性变化，使HIF-1蛋白与其下游的低氧反应元件发生作用，诱导肿瘤血管生成、改变细胞能量代谢方式等发挥低氧调节能力[1]。目前已有许多研究证实，HIF-1在多种恶性肿瘤组织中呈高表达，并在肿瘤生长、侵袭方面起着重要作用[2-5]。在本研究中，淋巴瘤组HIF-1α、HIF-2α 阳性表达率均显著高于淋巴结增生组（P＜0.05），提示淋巴瘤中HIF-1α、HIF-2α 的表达可能参与淋巴瘤发生、发展过程的调控，并有助于良、恶性淋巴结病变的鉴别。尽管HIF-1α、HIF-2α 均参与缺氧的调节，但两者担任角色不同，HIF-1α主要调节缺氧早期及急性期的适应性反应，而肿瘤的长期和慢性缺氧过程中主要由HIF-2α 介导，这说明在不同的缺氧时期，参与调控肿瘤组织缺氧适应的HIF分子不同。有研究显示，缺氧急性期HIF-1α表达明显增加，随着缺氧时间延长，HIF-1α 浓度逐渐下降，而HIF-2α 表达水平逐渐升高[3]。本研究结果显示，HIF-1α与HIF-2α 表达呈正相关关系，提示两者在淋巴瘤发生、发展的过程中可能具有协同作用，但明确两者的动态变化还需要开展更多的临床研究加以证实。

GLUT-1是分布在细胞膜上的一类跨膜蛋白，是介导葡萄糖进入细胞内的载体，同时也是HIF-1的靶基因。多项文献表明，恶性肿瘤如头颈部肿瘤、肺癌、乳腺癌组织中GLUT-1的表达高于正常组织[4-8]。本研究检测结果也显示，淋巴瘤组中GLUT-1表达率明显高于淋巴结增生组，其原因可能是恶性肿瘤组织代谢旺盛，需要摄取更多的能量，糖酵解较正常细胞高。此外，本研究结果还显示，HIF-1α、HIF-2α与GLUT-1的表达呈正相关关系，与马宗丽等[9]研究结果一致，证实了两者之间的协同作用。缺氧条件下，GLUT-1作为HIF-1的靶基因，被激活转录，促使糖酵解增加以适应乏氧环境，HIF-1α可通过介导乏氧反应基因的调控而上调GLUT-1的表达[9]。同时，也表明两者共同参与恶性肿瘤生长过程的调控。

研究表明，在许多实体瘤中，HIF-1α 高表达已被证明与预后较差、转移风险增加和死亡率升高相关[10-12]；也有一些研究显示，GLUT-1是影响原发性中枢系统淋巴瘤无进展生存期的不利预后因素[13]。IPI是由国际非霍奇金淋巴瘤预后因素协作组于1993年提出的一个淋巴瘤预后判断模型，国内、外已有研究就IPI的预后意义评价进行补充和完善，以期纳入更有效的指标以便更全面地评估非霍奇金淋巴瘤患者的预后[14-16]。本研究结果显示，IPI 3～5分组HIF-1α、HIF-2α及GLUT-1蛋白的阳性表达率高于0～2分组；且HIF-1α、HIF-2α、GLUT-1的阳性表达与IPI评分呈正相关关系，表明HIF-1α、HIF-2α、GLUT-1可能是非霍奇金淋巴瘤预后不良的高危因素。

综上所述，HIF-1α、HIF-2α和GLUT-1三者对淋巴瘤的发生、发展过程有着重要的调控作用，检测HIF-1α、HIF-2α和GLUT-1有助于良、恶性淋巴结病变的鉴别。另外，HIF-1α、HIF-2α、GLUT-1与IPI评分呈正相关关系，三者可能是非霍奇金淋巴瘤预后不良的高危因素，对非霍奇金淋巴瘤高危人群的筛查和评估有一定的临床意义。三者可否作为非霍奇金淋巴瘤的预后生物指标，还有待扩大样本量进一步研究。