女贞子提取物对帕金森病大鼠的神经炎症及AMPK/ERK信号通路的影响*

杨芬，谭一虎，肖鸣△

（1.长江航运总医院老年病科，武汉 430010；2.湖北省中西医结合医院神经外科，武汉 430024）

帕金森疾病（Parkinson’s disease，PD）是一种在中老年阶段常见的慢性神经性系统疾病，临床症状主要包括运动症状和非运动症状，运动症状包含肌强直、运动缓慢等，非运动症状包括便秘、睡眠障碍、抑郁等，严重影响患者的心理和日常生活[1-2]。PD发病机制复杂，与氧化应激、遗传、线粒体断裂、炎症反应等过程均有关系，但尚无统一定论[3]。美多芭、左旋多巴、安坦等作为PD疾病常用药物，虽然疗效确切，但副反应明显，无法从根本上治疗PD[4]，因此寻找高效的治疗PD药物是国内外学者的研究焦点。女贞子提取物（extract of Ligustrum lucidum，LLE）具有抗炎、抗肿瘤、降血糖血脂、护肝等药理价值，在许多疾病治疗中发挥较好的药理作用[5]，但是LLE对PD疾病的治疗鲜有报道。腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine-activated protein kinase，AMPK）/细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulatory protein kinase，ERK）信号通路在细胞抵抗氧化应激损伤、炎症反应中起到重要作用，已然成为国内外学者研究的重点之一。6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）是一种常用的导致多巴胺（dopamine，DA）能神经元变性的神经毒剂，包括内源性和外源性两种，一旦DA能神经元摄入外源性6-OHDA，导致大量自由基释放，最终造成神经元受损而死亡。本实验通过6-OHDA构建PD大鼠模型，给予大鼠LLE干预，旨在研究LLE对PD大鼠神经炎症以及AMPK/ERK信号通路的影响，以期为治疗PD提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 健康SD大鼠100只（清洁级、7～8周龄、雄性、体重200～230 g），由北京赛特明强医药科技有限公司提供，许可证号：SYXK（京）2021-0044。实验动物饲养环境：温度22～25℃，湿度55%～75%，自由进食、进水。本研究所有动物实验经动物伦理委员会批准且遵循国家《实验动物管理条例》。

1.1.2试剂与仪器LLE购自陕西中鑫生物技术有限公司；LLE提取方法：将100 g女贞子粉末加入规格为1 000 mL圆底烧瓶中，经纯水浸泡30 min后，加入回流装置中提取，过滤收集煎液；将滤渣再次回流提取，收集；药煎液经真空减压等操作，浓缩至1 g/mL，得到LLE浓缩液；将浓缩液离心，将上清液经过冷冻、干燥得到固体粉末，即为LLE；抗坏血酸购自于默克公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）、肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）（货 号：ml063357、ml076328、ml002859、ml077384）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）（货号：kt27865）由武汉默沙克生物科技有限公司提供；AMPK、ERK、p-AMPK、酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）鼠 抗（货 号：ab32047、ab32537、ab133448、ab137869）购自Abcam公司；p-ERK（sc-7383）购自上海易汇生物科技有限公司；6-OHDA购自北京百奥莱博科技有限公司；D-SW50光学显微镜购自于深圳市博视达光学仪器有限公司；酶标仪购自上海美谷分子仪器有限公司；HT-600C通用电泳仪由北京鸿涛基业科技发展有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 PD大鼠模型的制备、分组、给药 参照吕慧君等[6]方法建立PD大鼠模型：随机选取85只大鼠，经腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉后，固定于立体仪上，切开颅顶皮肤，定位纹状体，于前囟前1.0 mm、中线右3.0 mm作为注药点1，前囟后0.2 mm、中线右2.7 mm、硬膜下5.0 mm作为注药点2，用微量注射器于上述两个注药点分别注入4µL含0.2%抗坏血酸的6-OHDA，术后缝合伤口，同时预防伤口感染。术后喂养1周，给予注射0.5 mg/kg阿扑吗啡，观察大鼠旋转行为。当大鼠在30 min内，向左旋转圈数多于210圈时，说明PD大鼠建模成功[7]。建模过程中，大鼠死亡10只。将剩余75只大鼠随机分为模型组、LLE剂量组（低、中、高）、阳性对照组，每组15只；另取15只正常大鼠作为对照组；LLE低、中、高剂量组分别给予0.2 g/kg、0.4 g/kg、0.8 g/kg LLE灌胃[8]，阳性对照组给予1.67 mg/kg美多芭灌胃[9]，对照组、模型组大鼠灌胃等体积的生理盐水，各组大鼠每天灌胃1次，连续15 d。

1.2.2行为学检测及样本收集 分别于干预前、后统计各组大鼠30 min内旋转圈数。行为学测定结束后，用戊巴比妥钠麻醉并断头处死大鼠，低温快速分离出含黑质部位的脑组织，一部分置于4%多聚甲醛固定，用于免疫组化法检测TH阳性细胞数；另一部分置于-80℃冰箱保存，用于ELISA、western blotting检测。

1.2.3 ELISA检测脑组织中氧化应激、炎症因子水平 取适量脑组织，加入PBS制备匀浆，4℃离心15 min（4 000 r/min），取上清液，严格按照ELISA试剂盒操作说明书检测脑组织中TNF-α、MDA、GSH、SOD、NO含量。

1.2.4免疫组化法检测TH阳性细胞数取4%多聚甲醛固定后的脑组织，在不同梯度的乙醇溶液中分别脱水5 min，制备石蜡切片，切片常规脱蜡，加入按照1∶500稀释后的TH一抗，4℃孵育过夜，经TBST洗涤，加入按照1∶5 000生物素化二抗室温孵育1 h，PBS清洗，显色剂显色，中性树脂封片。每组选5张切片，每张切片选取4个不同视野，分别统计TH阳性细胞数。

1.2.5 Western blotting法检测大鼠脑组织中AMPK、ERK蛋白表达 取适量脑组织，加入裂解液，研磨并离心10 min（4℃、12 000 r/min）提取总蛋白，BAC蛋白定量试剂盒定量分析、SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳、转膜、封闭，加入以1∶1 000稀释的AMPK、ERK一抗，4℃恒温箱孵育过夜，PBST缓冲液洗涤；加入1∶1 500稀释的二抗室温孵育1 h，ECL显色、凝胶成像仪拍照，分析灰度值，以β-actin为内参，定量AMPK、ERK蛋白表示水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验；以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PD大鼠行为学检测

与对照组相比，模型大鼠旋转圈数增加（P＜0.05）；与模型组相比，随着LLE剂量增加，大鼠旋转圈数减少（P＜0.05），其中LLE高剂量组与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 LLE对PD大鼠旋转圈数的影响圈，，n=15

表1 LLE对PD大鼠旋转圈数的影响圈，，n=15

与对照组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与LLE 低剂量组相比，cP＜0.05；与LLE 中剂量组相比，dP＜0.05，与本组干预前相比，eP＜0.05。

2.2 LLE对大鼠脑组织中氧化应激水平的影响

与对照组相比，模型组大鼠MDA含量明显升高（P＜0.05），GSH、SOD含量均降低（P＜0.05）；与模型组相比，随着LLE剂量增加，MDA含量降低，GSH、SOD含量升高（P＜0.05）；LLE高剂量组变化最为明显，但各项指标与阳性对照组比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

表2 LLE对PD大鼠脑组织中氧化应激水平的影响 ，n=15

表2 LLE对PD大鼠脑组织中氧化应激水平的影响 ，n=15

与对照组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与LLE 低剂量组相比，cP＜0.05；与LLE 中剂量组相比，dP＜0.05。

2.3 LLE对大鼠脑组织中TNF-α、NO水平的影响

与对照组相比，模型组大鼠TNF-α、NO含量增加（P＜0.05）；与模型组相比，LLE低、中、高剂量组TNF-α、NO含量随着剂量增加，逐渐降低（P＜0.05）；LLE高剂量组变化最为明显，与阳性对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 LLE对PD大鼠脑组织中炎症因子水平的影响 ，n=15

表3 LLE对PD大鼠脑组织中炎症因子水平的影响 ，n=15

与对照组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与LLE 低剂量组相比，cP＜0.05；与LLE 中剂量组相比，dP＜0.05。

2.4 LLE对大鼠脑组织中TH阳性细胞数的影响

对照组大鼠TH阳性细胞数较多，细胞有序排列，细胞质颜色较深，突起明显；与对照组相比，模型组大鼠细胞排布紊乱，细胞质颜色较深，突起短小，TH阳性细胞数明显减少（P＜0.05）；与模型组相比，随着LLE剂量增加，细胞排布逐渐整齐有序，细胞质颜色加深，突起逐渐变粗、变长，TH阳性细胞数逐渐增加（P＜0.05），LLE高剂量组各指标与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图1、表4。

表4 LLE对PD大鼠TH阳性细胞数的影响 ，n=15

表4 LLE对PD大鼠TH阳性细胞数的影响 ，n=15

与对照组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与LLE 低剂量组相比，cP＜0.05；与LLE 中剂量组相比，dP＜0.05。

图1 ENZZ对PD大鼠TH阳性细胞数的影响（×100）

2.5 LLE对大鼠脑组织中AMPK、ERK蛋白表达

与对照组相比，模型组大鼠脑组织中p-AMPK/AMPK、p-ERK/ERK比值均降低（P＜0.05）；与模型组相比，LLE低、中、高剂量组p-AMPK/AMPK、p-ERK/ERK比值均增加（P＜0.05），LLE高剂量组p-AMPK/AMPK、p-ERK/ERK比值最高，与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表5、图2。

图2 各组大鼠脑组织p-AMPK、AMPK、p-ERK、ERK表达

表5 LLE 对大鼠脑组织中p-AMPK、AMPK、p-ERK、ERK表达的影响 ，n=15

表5 LLE 对大鼠脑组织中p-AMPK、AMPK、p-ERK、ERK表达的影响 ，n=15

与对照组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与LLE 低剂量组相比，cP＜0.05；与LLE 中剂量组相比，dP＜0.05。

3 讨论

PD属于第二大神经性退行性疾病，仅次于阿尔兹海默病，其发病率高达0.3%[10]。DA神经元的大量缺失和退化是造成PD的主要原因，与遗传、炎症反应、衰老、氧化应激等过程密切相关[11]。本实验经腹腔注射6-OHDA建立PD大鼠模型，在行为学检测结果中，观察到干预前模型组、药物组以及阳性对照组中大鼠在30 min内旋转圈数均多于210圈，表明PD大鼠模型构建成功。

药物治疗PD，虽然有一定的疗效，但长期治疗引发的并发症以及经济负担都会引起患者的信心缺失[12]。而中医药治疗PD历史悠久，多层次、多靶点以及多途径的优势使得中医药在PD治疗中具有广阔的应用前景[13]。女贞子属于木犀科植物，分布广泛，其提取物含有多种中药成分如熊果酸、黄酮类化合物、女贞子苷，具有广泛的药理作用，在治疗肝病[14]、糖尿病[15]、骨质疏松[16]等疾病中疗效显著，但是在治疗PD方面很少报道。TNF-α 作为一种重要的细胞因子，在PD发病过程中起破坏作用。另外，在神经细胞内会生成NO小分子化合物，这种物质具有广泛的生物学效应，但含量一旦超标，便会造成细胞损伤[17]。本实验选用不同剂量的LLE进行干预，结果发现，与模型组相比，LLE组随着剂量增加，大鼠旋转圈数及脑组织TNF-α、NO含量均减少，表明LLE可以抑制炎症反应，改善PD大鼠不良症状。

研究表明，氧化应激是致使神经退行性疾病发生的潜在机制[18]。TH在形成DA过程中起关键作用，产生使TH失活的大量自由基，诱发PD。SOD、GSH作为抗氧化剂，可以清除超氧自由基，阻止羟自由基产生，避免氧化应激引起细胞。MDA是一种脂质过氧化物，间接反映细胞受损程度[19]。AMPK作为调节因子，刺激合成线粒体，增强氧化代谢，维持代谢平衡，参与各种应激反应。ERK作为蛋白激酶家族中的一员，一旦被激活，便向细胞核传递信息，进而调节细胞生长、增殖、分化、凋亡等[20]。本实验结果发现，经不同剂量的LLE干预后，大鼠旋转圈数及脑组织MDA含量均随着LLE剂量增加而降低，TH阳性细胞数，GSH、SOD水平及p-AMPK/AMPK、p-ERK/ERK比值则呈现增加趋势；LLE高剂量组各项指标与阳性对照组无明显差异。表明LLE可以抑制PD大鼠氧化应激损伤，促进TH表达，可能与激活AMPK/ERK信号通路有关。

综上所述，LLE可能通过激活AMPK/ERK信号通路，可改善PD大鼠氧化应激水平，减轻炎性反应，为中医药治疗PD疾病提供了新的药物参考，但作用机制较为复杂，有待进一步研究。