基于网络药理学及体外实验探讨蛭岩消积方治疗肝癌的作用机制*

仇雯霞，谢小慧，陈欣欣，王宗玉，陈闯△

（1.广西医科大学第一附属医院，南宁 530021；2.广西中医药大学，南宁 530200；3.广西医科大学附属肿瘤医院，南宁 530021）

原发性肝癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率目前仍位居高位[1]。临床研究表明，中医药对肝癌防治有独特的优势[2-4]，但大多数方药作用机制不明确，阻碍了中医药的推广应用。蛭岩消积方是广西医科大学附属肿瘤医院的院内制剂（备案号：桂药制备字M20220001000），组方包括岩黄连、水蛭、白花蛇舌草、党参、柴胡、莪术、绞股蓝、薏苡仁。研究表明，蛭岩消积方能减轻肝癌患者的临床症状，提高患者的生活质量，但蛭岩消积方的抗肝癌机制尚未明确。本研究拟通过网络药理学预测蛭岩消积方治疗肝癌的作用靶点及通路，并进行体外实验对相关的分子机制进行初步验证，为蛭岩消积方的抗肝癌机制研究提供前期基础。

1 材料与方法

1.1细胞 人肝癌细胞HepG2由广西医科大学附属肿瘤医院中心实验室提供，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基（含青—链霉素100 U/mL），置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。

1.2主要试剂FBS、DMEM、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；青—链霉素混合液、姬姆萨、4%多聚甲醛、二甲基亚砜（DMSO）、PBS购自北京索莱宝公司；Matrigel基底膜基质购自美国Corning公司；CCK8检测试剂盒购自日本东仁公司；细胞周期试剂盒购自杭州联科生物；兔抗PI3K、AKT、mTOR、磷酸化（p-）PI3K、p-AKT、p-mTOR、CDK2、CyclinA、p-CHK1、Cdc25A购自博奥森；二抗购自碧云天。

1.3蛭岩消积方水提物的制备 蛭岩消积方从广西医科大学肿瘤医院药房采购。蛭岩消积方加15倍水，煎煮1 h后，用400目滤布过滤，浓缩成膏，冻干机干燥成粉，临用时用培养基溶解，0.22μm微孔滤器过滤除菌。

1.4 CCK8法检测细胞增殖 常规培养细胞，收集对数生长期细胞，按5×103个/孔的密度接种于96孔细胞培养板；待细胞贴壁后，加入不同浓度（3 200μg/mL、1 600μg/mL、800μg/mL、400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL和25μg/mL）蛭岩消积方水提物，对照组加入等量培养基，培养48 h；加入CCK8溶液10μL，继续培养1.5 h，用酶标仪检测450 nm波长处各孔的吸光度（OD）值。计算半数抑制浓度（IC50），选取IC50附近低、中、高浓度继续培养24 h、48 h、72 h。计算细胞增殖抑制率，即（1-实验组OD值）/对照组OD值×100%。

1.5 Transwell检测细胞迁移和侵袭 收集细胞，分别加入低、中、高浓度蛭岩消积方水提物，培养48 h；调整细胞密度为2×105个/mL，取200 µL无血清DMEM细胞悬液接种于小室，24孔板下室中加入600µL含20%FBS的DMEM培养基，培养24 h；弃去小室内培养液，姬姆萨染液室温染色30 min，清洗风干，光镜下观察记录膜背面迁移的细胞数。侵袭实验将Transwell小室膜底部用Matrigel稀释胶包被、水化，处理方法同迁移实验。

1.6流式细胞术检测细胞周期 收集低、中、高浓度蛭岩消积方处理后的细胞，用0.25%胰酶消化，4℃下离心5 min，弃上清液；加入1 mL DNA Staining solution和10μL Permeabilization solution，涡旋振荡10 s混匀；室温避光孵育30 min，选择最低上样速度，用流式细胞仪检测。

1.7 Western blotting法检测细胞周期相关蛋白及PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达 提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度；10%SDS-PAGE电泳分离蛋白，湿转法将蛋白转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h；分别加入一抗PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、CDK2、CyclinA、p-CHK1、Cdc25A（均1∶1 000）4℃孵育过夜，加入二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，ECL化学发光显色液曝光、显影。采用Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.8蛭岩消积方肝癌治疗靶点的获取 本研究利用中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP（https://www.tcmspw.com/tcmsp.php）、Batman-TCM数据库（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php）以及文献检索[5]收集蛭岩消积方组成药物的活性成分及作用靶点。在TCMSP中以口服生物利用度（OB）≥20%、类药性（DL）≥0.18为筛选标准，在Batman-TCM中以Score cut off≥20，校正P值＜0.05为筛选标准，得到有效的活性成分及靶点。将获得的靶点蛋白名导入到Uniprot（https://www.uniprot.org/）数据库，设置物种为“Homo sapiens”，获取标准基因名，即为蛭岩消积方的所有靶点。以“hepatocellular carcinoma”及“Liver cancer”为关键词，从GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、OncoDB.HCC（http://oncodb.hcc.ibms.sinica.edu.tw/index.htm）中查询肝癌相关基因，将所有得到的基因合并后去除重复，即为肝癌相关的疾病基因。将获得的疾病靶点与获得的蛭岩消积方靶点取交集即可得到蛭岩消积方治疗肝癌的潜在作用靶点。

1.9蛭岩消积方治疗肝癌的关键靶点和蛋白—蛋白相互作用（PPI）网络构建 将蛭岩消积方治疗肝癌的潜在靶点导入STRING数据库（https://stringdb.org/）构建PPI网络。选择物种为“homo sapiens”，将交互得分最高置信度设置为≥0.9，隐藏游离靶点，其余参数保持默认设置，得到靶蛋白之间的PPI网络，并将相互作用信息导入Cytoscape3.8.2软件中。利用CytoNCA功能对PPI网络进行分析，计算各节点的度中心度（DC）、中间性中心性（BC）、紧密性中心性（CC）、特征向量中心性（EC）、网络中心性（NC）和局部平均连通性（LAC）。利用R语言进行筛选，同时满足大于各因素中位值的条件，得出核心网络。

1.10蛭岩消积方治疗肝癌靶点的GO功能分析和KEGG通路富集分析 基于Metascape（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）及R语言（version 3.6.3）中的ggplot2、clusterProfiler、AnnotationHub、org.Hs.eg.db、DOSE、ggpurb程序包对蛭岩消积方治疗肝癌的靶点进行KEGG通路富集分析及GO功能富集分析，并对富集分析的结果进行可视化。

1.11统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1蛭岩消积方治疗肝癌的靶点 依据筛选条件，去除无靶点对应和重复项后得到93种有效活性成分，其中白花蛇舌草有8个化合物，柴胡有16个化合物，党参有22个化合物，莪术有2个化合物，绞股蓝有19个化合物，水蛭有15个化合物，薏苡仁有7个化合物，岩黄连有12个化合物，重复化合物8种。查询上述93种有效活性成分对应的靶蛋白，将得到的靶蛋白输入到Uniprot数据库，物种选择人类，共得到399个经人工注释的人类基因，通过数据库检索肝癌的相关作用靶点有17 034个（图1），两者取交集得到蛭岩消积方作用于肝癌的靶点381个（图2）。

图1 4个数据库的基因并集

图2 药物与疾病靶点的交集基因

2.2关键靶点的获得及PPI网络图 首次筛选的阈值为DC≥21、EC≥0.017 619、LAC≥9、BC≥178.963 4、CC≥0.231 436、NC≥10.177 12，得到106个节点，7 454条边的网络图；第2次筛选阈值为DC≥75、EC≥0.091 881、LAC≥36.357 14、BC≥810.798 2、CC≥0.252 513、NC≥48.678 17，得到30个节点，3 282条边的网络图。经过2次筛选后得到核心网络（图3），表1所示的作用靶点均为PPI网络中度值较高且受到蛭岩消积方中药物活性成分调控的靶点蛋白，为蛭岩消积方治疗肝癌的关键靶基因。

表1 蛭岩消积方治疗肝癌的关键靶点

图3 关键靶点的筛选过程

2.3蛭岩消积方治疗肝癌靶点的GO及KEGG分析GO富集包括3个模块，分别为生物学过程（BP）、细胞组成（CC）和分子功能（MF）。主要涉及癌症通路、细胞对有机环化合物的反应、细胞对氧水平的反应、前列腺癌、离子迁移的调节、IL-4和IL-13通路、对无机物的反应、光动力疗法诱导NF-κB生存信号、炎症反应、体液水平的调节等（图4）。KEGG通路富集分析中，取校正过的P值最小的前30条通路。蛭岩消积方治疗肝癌的靶蛋白主要富集在PI3K/AKT、乙肝、丙肝、前列腺癌、AGE-RAGE、IL-17、TNF等信号通路（图5）。

图4 蛭岩消积方治疗肝癌靶点的GO富集分析

图5 蛭岩消积方治疗肝癌靶点的GO富集分析

2.4蛭岩消积方水提物抑制HepG2细胞增殖、迁移和侵袭 蛭岩消积方水提物作用于HepG2细胞48 h的IC50为1 499μg/mL，故选择800μg/mL、1 600μg/mL、2 400μg/mL作为蛭岩消积方水提物低、中、高剂量处理HepG2细胞72 h。

随着蛭岩消积方水提物浓度的增加和作用时间的延长，HepG2细胞增殖活性逐渐降低；随着蛭岩消积方水提物浓度的增加，迁移细胞数和侵袭细胞数逐渐减少，见图6、表2。

表2 各组迁移和侵袭细胞数比较 ，n=3

表2 各组迁移和侵袭细胞数比较 ，n=3

与对照组比较，*P＜0.05。

图6 蛭岩消积方水提物对HepG2细胞增殖、侵袭和迁移的影响

2.5蛭岩消积方水提物对细胞周期的影响 与对照组比较，蛭岩消积方水提物中、高剂量组G1期细胞所占比例减少，S期细胞所占比例增加，见图7。

图7 蛭岩消积方水提物对细胞周期的影响

2.6各组细胞周期相关蛋白及PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达比较 与对照组比较，蛭岩消积方水提物中、高剂量组CDK2、Cdc25A、CyclinA蛋白表达量及p-AKT/AKT比值、p-PI3K/PI3K比值降低，p-CHK1蛋白表达量升高；各组p-mTOR/mTOR比值比较，差异无统计学意义，见图8、表3。

图8 Western blotting蛋白电泳图

表3 各组细胞周期相关蛋白及PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达比较 ，n=3

表3 各组细胞周期相关蛋白及PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达比较 ，n=3

与对照组比较，*P＜0.05。

3 讨论

本研究发现，蛭岩消积方水提物以浓度依赖的方式抑制肝癌HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭。通过网络药理学KEGG富集结果可知，PI3K/AKT通路是蛭岩消积方作用于肝癌的相关重要通路之一，且组方药物有效成分的靶点均参与PI3K/AKT通路。PI3K与AKT组成的信号通路与多种生物信号调节有关，其作用包括抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，促进血管生成，同时还与肝癌细胞的迁移和侵袭密不可分，在肝癌的发生和发展中发挥重要作用[6-9]。mTOR是PI3K/AKT信号通路的主要下游靶点，是一个关键的细胞代谢调节因子。本研究中，蛭岩消积方中、高剂量组PI3K、AKT的磷酸化水平显著下降，但mTOR磷酸化水平无明显变化，推测蛭岩消积方水提物可能通过阻断PI3K/AKT信号通路抑制HepG2细胞增殖。中药复方具有多靶点、多途径的作用特点，且磷酸化和降解之间的相互关系是复杂的，因此仍需进一步的研究。

细胞增殖失控是癌细胞的一个基本特征，而这种失控是由细胞周期调控紊乱引起的[10]。CDK2是CDK家族中的重要成员，为PI3K/AKT通路的下游蛋白，可与CyclinE和CyclinA相互结合，启动DNA合成，促进细胞分裂，加快细胞周期[11]。Cdc25A与CDK2相互促进，在多种肿瘤中呈高表达，参与肿瘤的发生、发展，并与肿瘤的恶性程度和预后有关[12-13]。研究表明，调控Cdc25A降解可阻滞细胞周期，活化的CHK1通过磷酸化Cdc25A的第82位丝氨酸，促进Cdc25A的泛素化降解，最终导致G1/S期阻滞[14-15]。本研究中，蛭岩消积方水提物下调CDK2、Cdc25A、CyclinA蛋白表达，同时上调p-CHK1蛋白表达；细胞周期实验显示，该药可将肝癌细胞阻滞在S期，从而抑制细胞增殖。

综上所述，蛭岩消积方水提物可能通过阻断PI3K/AKT信号通路抑制HepG2细胞增殖、侵袭和迁移。本组今后将开展蛭岩消积方作用于肝癌小鼠的体内研究，以期为蛭岩消积方在肝癌临床治疗中的应用提供更多的实验依据。