朝天罐总酚对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞炎症反应的调控作用*

张琳珮，陈依雨，陆洪艳，史雯雪，郭 玲，蒋霞

（广西医科大学第一附属医院，南宁 530021）

炎症是人体抵御外源性入侵物或调节机体免疫反应失调必不可少的防御手段[1]。在炎症反应过程中，巨噬细胞参与机体的免疫反应，在炎症反应过程中具有重要作用[2]。研究显示，中草药可降低脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞中肿瘤坏死因子（TNF）-α、一氧化氮（NO）等炎症因子水平[3-4]。朝天罐（Osbeckia opipara C.Y.Wu et C.Chen）为野牡丹科金锦香属植物，是广西少数民族地区的常用药材，主要以根入药，其味甘、微苦，性平，归肾、大肠经，功能益肾、止血、解毒[5-6]。目前大量研究表明，酚类化合物在抗炎方面有很高的研究价值和应用前景[7-8]。本课题组前期研究发现，朝天罐总酚为朝天罐根中重要的活性物质，朝天罐粗提物具有抗炎作用[9-11]。但目前对LPS刺激下朝天罐总酚的抗炎作用研究尚未见报道。本研究以小鼠巨噬细胞（RAW264.7）为研究对象，探讨朝天罐总酚对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应的作用，为深入研究朝天罐抗炎活性提供实验依据。

1 材料与方法

1.1药物 朝天罐采于广西金秀瑶族自治县，经广西医科大学天然药物与生药学教研室焦爱军教授鉴定为野牡丹科植物朝天罐的根。采用课题组前期研究方法制备朝天罐总酚纯化物[9]，临用前以无菌培养基稀释至所需浓度。

经计算，研究区内黑云母二长花岗岩岩石生热率估算为3.23～12.34 μW/m2，平均值5.24 μW/m2，除孔深600 m处岩石生热率突变外，整体上比较稳定，处于3.23～5.18 μW/m2，见图2，其中U、Th和40K放射性产热分别占岩石生热率的30.84%、59.68%、9.48%，说明岩石生热率主要依靠铀钍贡献，钾贡献率较小，研究区岩石生热率高于世界范围内花岗岩放射性生热率平均值2.5 μW/m2，为高产热花岗岩(HHP)。

1.2细胞和主要试剂 小鼠单核巨噬细胞RAW264.7购自中国科学院上海细胞库。LPS（美国Sigma公司，批号：L2880）；地塞米松（北京索莱宝科技有限公司，批号：503F051）；NO试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20200617）；TNF-α、白细胞介素（IL）-6酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（Elabscience公司，批号：UGS26LDTHZ、ZMH73FDG6E）；中性红细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（碧云天生物技术研究所，批号：070720200930）。

1.3细胞培养和分组RAW264.7细胞用含10%胎牛血清、1%青—链霉素的高糖DMEM培养基，并置于5%CO2、37℃的细胞培养箱中培养。将细胞分为正常对照组、模型组、阳性对照组及不同浓度（1.88μg/mL、3.75μg/mL、7.5μg/mL、15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL）朝天罐总酚组。模型组加入1μg/mL的LPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症模型，阳性对照组加入10μg/mL地塞米松，正常对照组不予处理。

单卧轴搅拌机是由德国公司开发的。双水平轴搅拌机是随着混凝土施工技术的逐步完善而发展起来的新型机型。国外从第二十世纪末开始在美国和德国，但轴封技术不成熟，其发展基本上处于停滞状态。直到七十年代初，这项技术已形成了一系列产品。早在上世纪80年代中国的发展，但发展迅速，在产品说明书和产品的数量，都远远超过了其他模型。

反季节种植即是在植物的非正常栽植时间进行种植，其在一定程度上违背了植物的正常生长规律，如果在种植过程中技术处理不当、苗木选择不当，那苗木的成活率就得不到保证。为有效提升苗木成活率，保证工程施工质量，在选择苗木时应注意以下要点：

1.4 MTT法检测细胞增殖 取对数生长期的RAW264.7细胞以1.2×105个/mL的密度接种于96孔板中，每孔100μL。培养24 h后吸弃上清液，细胞分组处理后，置于5%CO2、37℃的细胞培养箱中培养24 h；每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20μL，继续培养4 h，弃掉细胞培养液，每孔加入150μL DMSO，避光振摇10 min；用酶标仪测定490 nm波长处各孔的吸光度（OD）值，计算细胞存活率，即实验组OD值/空白对照组OD值×100%。

1.6 NO含量检测 取对数生长期RAW264.7细胞以2×105个/mL接种于6孔板中。培养24 h后吸弃培养基，细胞分组处理后，置于5%CO2、37℃的细胞培养箱中培养24 h；收集细胞培养上清液，1 000 r/min离心5 min，取上清液；采用Griess法检测细胞上清液中NO的含量，用酶标仪测定550 nm波长处各孔的OD值。检测过程严格按照NO试剂盒说明书进行操作。

1.5 RAW264.7细胞吞噬功能检测 取对数生长期RAW264.7细胞按1×106个/mL接种于96孔板，每孔200μL。培养24 h后吸弃培养基，细胞分组处理后，置于5%CO2、37℃的细胞培养箱中孵育24 h；弃上清液，PBS清洗，每孔加入200μL细胞培养基，并加入20μL中性红染色液，继续培养2 h；吸弃细胞培养基，PBS清洗，每孔加入200μL中性红裂解液，于摇床上振摇10 min；用酶标仪检测540 nm波长处各孔的OD值，计算吞噬指数，即实验组OD值/空白对照组OD值。

2.4朝天罐总酚对LPS诱导RAW264.7细胞TNFα、IL-6含量的影响 与空白对照组比较，模型组细胞上清液中TNF-α、IL-6含量升高；与模型组比较，朝天罐总酚中、高剂量组细胞上清液中TNF-α含量降低，朝天罐总酚各剂量组IL-6含量降低，见表1。

2.1朝天罐总酚对LPS诱导RAW264.7细胞存活率的影响 不同浓度的LPS刺激RAW264.7细胞24 h后，细胞存活率在（100±10）%范围内，可视为对细胞活力无影响。模型组与空白对照组细胞存活率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与空白对照组比较，朝天罐总酚30μg/mL、60μg/mL组细胞存活率降低，而当朝天罐总酚浓度≤15μg/mL时，RAW264.7细胞存活率均高于90%，与空白对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），可视为无细胞毒性，见图1。

2.3朝天罐总酚对LPS诱导RAW264.7细胞NO含量的影响 与空白对照组比较，模型组细胞上清液中NO含量升高；与模型组比较，朝天罐总酚中、高剂量组和阳性对照组细胞上清液中NO含量降低，见图3。

2 结果

潘国文曾说“中国人善形象思维，西方人善逻辑思维”，其中，形象思维就是我们常说的具体思维，而逻辑思维即抽象思维。由此看来，汉民族更注重具体思维，而西方民族更倾向于抽象思维。

建立促进融资租赁业发展的政策支持体系。引进融资租赁公司、设立分支机构，支持符合条件的各类资本设立融资租赁公司，提高融资租赁对经济发展各行业的覆盖面和市场渗透率[4]；支持设立专门面向中小微企业的融资租赁公司，发挥其融资便利、期限灵活、财务优化的优势，提供适合中小微企业特点的产品和服务；鼓励融资租赁公司加大对通用航空、支柱产业、教育医疗、现代农业、中小微企业等领域的支持力度，拓宽融资渠道。

图1 不同浓度朝天罐总酚对LPS诱导RAW264.7细胞存活率的影响

2.2朝天罐总酚对RAW264.7细胞吞噬功能的影响 与空白对照组比较，朝天罐总酚（3.75μg/mL、7.5μg/mL、15μg/mL）能增强RAW264.7细胞的吞噬能力（图2），故选择3.75μg/mL、7.5μg/mL、15μg/mL作为低、中、高给药浓度进行后续试验。

图2 不同浓度朝天罐总酚对RAW264.7细胞吞噬功能的影响

1.8统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

图3 不同浓度朝天罐总酚对LPS 诱导RAW264.7 细胞NO含量的影响

1.7细胞上清液TNF-α、IL-6水平检测 采用ELISA法测定细胞上清液中TNF-α、IL-6的含量，用酶标仪测定450 nm波长处各孔的OD值。检测过程严格按照试剂盒说明书进行操作。

表1 不同浓度朝天罐总酚对LPS 诱导RAW264.7 细胞TNF-α、IL-6含量的影响 ，n=3

表1 不同浓度朝天罐总酚对LPS 诱导RAW264.7 细胞TNF-α、IL-6含量的影响 ，n=3

与空白对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01。

3 讨论

朝天罐主治腰膝酸软、咯血、痢疾、咽喉痛等疾病，其根的主要化学成分为酚类和鞣质[12-13]。本课题组前期研究发现，朝天罐总酚具有较强的体外抗氧化、抗癌作用[9,14]。本研究发现，朝天罐总酚能够提高LPS诱导的巨噬细胞增殖活性，减少细胞释放TNF-α、IL-6，抑制细胞产生NO，增强细胞吞噬能力。由此表明，朝天罐总酚具有抗炎作用。

LPS是细胞内毒素的有效成分，是激活机体炎症反应的重要诱导因子，其诱导的RAM264.7细胞炎症模型是一种常用的炎症反应模型[15-17]。在LPS的诱导下，RAW264.7细胞分泌大量炎症因子如TNF-α、IL-6、NO等，这些炎症因子将进一步活化RAW264.7细胞，从而加重炎症反应[18]。巨噬细胞是一种免疫细胞，可通过吞噬功能及分泌多种细胞因子等参与机体的免疫应答，是机体免疫系统的重要组成部分[19-20]。NO是炎症反应中的炎症介质之一，随着NO释放量的升高，巨噬细胞吞噬能力也增强，吞噬指数可以反映吞噬功能的强弱，是衡量巨噬细胞活性的一个重要指标[21]。本研究结果显示，朝天罐总酚可显著减少LPS诱导的巨噬细胞NO、TNF-α、IL-6的分泌，这提示朝天罐总酚可能通过调节巨噬细胞促炎性细胞因子的水平以活化巨噬细胞，进而增强吞噬能力来发挥抗炎作用。

综上所述，朝天罐总酚通过抑制炎症因子的分泌和产生，增强巨噬细胞的吞噬功能发挥抗炎作用，这为中药新药开发和临床应用提供了实验依据，但关于朝天罐总酚的抗炎作用机制仍有待进一步研究。