合水粉葛常见病害调查及病原菌分离鉴定

2022-04-28蔡永鹏刘琼光李敏华莫道铭

农业与技术 2022年8期

蔡永鹏刘琼光李敏华莫道铭

(1.佛山市高明区农业技术服务推广中心，广东佛山 528000；2.华南农业大学,广东广州 510642)

粉葛为豆科葛属植物，因具有较高的营养和药用价值，在广东、广西、湖南、江西、福建、四川、云南等地广泛种植。然而，粉葛有多个栽培品种，其中，佛山市高明区的合水粉葛是经国家质检总局审批的国家地理标志产品。合水粉葛在高明种植历史悠久，种植面积较大，作为高明的特产，合水粉葛对于地方经济有着重要的意义。受种植环境、栽培措施等影响，病害发生越来越严重，有必要对粉葛的病害进行调查及病原菌分离鉴定，为生产种植过程中病害防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病害标本采集

在高明区更合镇田间种植的粉葛，共采集218个病害标本带回实验室，用于病害鉴定。

1.1.2 常用培养基及缓冲液

1.1.2.1 PDA培养基

马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容到1L，121℃灭菌20min。

1.1.2.2 LB培养基

胰蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeast extract)5g，NaCl 10g，蒸馏水定容至1L，121℃灭菌20min。

1.1.2.3 1×TBE

54g Tris碱，27.5g硼酸，20mL0.5mol·L-1的EDTA(PH8.0)加1L水溶解，使用时稀释5倍。

1.1.2.4 0.5mol·L-1EDTA(pH8.0)

在800mL水中加入186.1g EDTA，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液pH至8.0，然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。

1.1.3 生化试剂及其他材料

Taq DNA聚合酶、dNTP、10×PCR Buffer等；DNA分子量标准DL 2000(DL2000DNAMarker)；DNA凝胶回收试剂盒；胰蛋白胨、酵母提取物(Yeast Extract)、琼脂(Agar)、葡萄糖、蔗糖等。

1.1.4 主要仪器

超净工作台、恒温培养箱、恒温培养摇床、低温冰箱、超纯水器、灭菌锅、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、电子天平、分析天平、微波炉、金属浴等。

1.2 试验方法

将采回的标本先在显微镜下观察病原菌喷菌现象，初步确定是侵染性病害还是非侵染性病害。

1.2.1 病原真菌分离

利用组织分离法对粉葛炭疽病菌进行分离，在超净台中，取带明显病害症状的植物叶片和茎组织，用双蒸水冲洗。取病健交界处的组织，用经无菌处理的手术刀裁剪成4～5mm大小的片状物或块状物，用75%的酒精漂洗1min，再放到0.1%的次氯酸钠溶液中漂洗3min。消毒后，用双蒸水冲洗3～4次。用已灭菌的镊子抓取消毒漂洗过的组织块，以每皿4～5块的数量，均匀排放在PDA平板上，放好后轻微按压，直到培养皿倒放时不会掉落。在培养皿上用记号笔记录相应信息。将载有组织块的培养皿倒置在30℃恒温培养箱中进行培养，4d后在超净台中，挑选培养基上未污染的菌落，用接种环在菌落边缘挑取1小块培养基，转移到新的培养基上，将有菌丝的那一面朝下接触培养基。多次重复试验，直到仅分离出1种菌。

1.2.2 科赫氏法则验证和致病性测定

在室内进行病原菌的致病性测定，用70%的酒精将健康粉葛茎切段进行表面消毒，并用双蒸水冲洗3次，放置在已经进行消毒的搪瓷托盘中。在粉葛茎秆切段的表面用已灭菌的针刺小孔。选取菌落直径已大约长至70mm的疑似病原菌的PDA培养基，在培养基最外围真菌生长最旺盛的部分，用已灭菌的打孔器打孔，获得约7mm的菌饼。将打孔获得的菌饼覆盖在粉葛茎秆切段表面的小孔上，并以空白PDA培养基作为对照。接着，每日用喷壶对粉葛茎切段表面喷洒双蒸水，放置在30℃恒温培养箱中，约4d后待粉葛茎切段出现发病情况，观察并记录是否出现与前期采集到的病株相同的症状。

若有发病，再从发病处取组织，对病原菌进行分离纯化，观察是否获得同分离步骤相同的致病菌，以此完成柯赫氏法则的验证。

1.2.3 病原真菌鉴定

1.2.3.1 形态学观察

将经柯赫氏法则验证后的菌株，转移到新的PDA培养基中，在30℃恒温培养箱中倒置培养7d，待菌落长到约70mm。对培养后的菌落外观、菌丝和分生孢子等形态特征进行观察，查找资料，进行形态学的鉴定，能够初步鉴定到病原菌的属。

1.2.3.2 分子生物学鉴定

选取经过验证，确实为致病菌的菌株，在超净台中刮下茂盛的菌丝至离心管中，令菌丝质量大约为100mg，来进行菌株的DNA的提取。完成真菌DNA提取后，对获得的DNA进行PCR扩增、序列测序和结果分析。PCR扩增体系如表1所示。

表1 PCR扩增体系

1.2.3.3 PCR反应参数

预变性94℃，5min；变性94℃，45s；退火53℃，45s；延伸72℃，1min；共35个循环。再延伸72℃，10min。扩增完将产物放入4℃冰箱中进行保存。将PCR扩增所得的DNA产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，将电泳产物在凝胶成像系统中进行观察。选取扩增条带清晰约540bp(base pair)的目标条带将其切下，进行凝胶回收。PCR扩增产物送到上海英骏生物技术有限公司进行测序。在DNAman软件中拼接测序结果，在GenBank数据库中进行序列的BLAST比对分析。

2 结果与分析

在高明区更合镇田间种植的粉葛，共采集218个病害标本，经显微镜观察，鉴定出常见的几种真菌病害。

2.1 粉葛拟锈病

粉葛拟锈病是一种常见发生的病害。该病除了危害叶片、叶柄外，还危害葛藤，通常在叶脉和叶柄处病斑最多，发病初期先出现褪绿黄斑，严重时形成黄色泡状隆起，见图1，后期在茎上呈肿瘤状，破裂后有黄色脓状物质散出，受害叶片容易早落，严重时植株萎蔫枯死。据调查，粉葛拟锈病每年4月开始零星发生，到12月收获期内都有发生，其发病特点是高温干旱时发病轻，梅雨季节发病重，病害严重田块，病株率达90%～100%。由葛藤集壶菌(Sychytrium puerariae)引起，见图2。

图1 粉葛拟锈病发病症状

图2 粉葛拟锈病菌显微镜下观察孢子囊形态

2.2 粉葛棒孢霉叶斑病

该病主要危害叶片、叶柄及葛藤，形成多角形或不规则形黑色病斑，见图3，潮湿环境下，病部产生黑色霉体，即为病原菌的分生孢子梗和分生孢子。分生孢子梗褐色，有分隔；分生孢子棍棒状，有多个隔膜，褐色，见图4。

图3 粉葛棒孢霉叶斑病为害症状

图4 棒孢霉真菌分生孢子形态

2.3 粉葛白绢病(Selerotium rolfsii)

白绢病主要危害粉葛块茎或茎基部，起初茎基部的表皮会变成褐色，随后茎基部表皮上会出现一些病斑，多数情况下病斑无规则。随着病情的发展，发病部位逐渐腐烂，表面或近地面土表覆有白色绢丝状菌丝体。后期在菌丝体内形成很多油菜籽状的小菌核，初为白色，后渐变为淡黄色至黄褐色，见图5。白绢病是一种典型的土传病害，寄主范围广，能够侵染许多作物，导致严重危害。

图5 粉葛白绢病在葛根上症状

2.4 粉葛枯萎病

粉葛枯萎病是一种土传病害，主要危害粉葛块根及茎蔓基部，近年在葛藤上也发现该病的危害。该病可在粉葛的全生育期发生，其中以6—8月发病最多，特别是台风过后会有发病高峰期。粉葛感病前期，葛根的尖端或中部表皮会出现褐色的水渍状病斑，靠近土表的茎蔓基部最容易发病，病部不规则形，病部变黑，茎开裂，湿度大时，可见病部产生大量的粉红色霉体(分生孢子)，感病后期茎基部皮下组织变褐色，出现干腐现象，植株逐渐萎蔫，枯死，见图6。