超高效液相色谱串联质谱法测定渔业水环境中七种氟喹诺酮类药物含量

高磊，王钟强，覃东立，陈中祥，吴松，汤施展，黄晓丽，孙承宇，黄丽,6，郝其睿，白淑艳，杜宁宁，李晨辉，王鹏

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070；2.农业农村部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心（哈尔滨），黑龙江 哈尔滨 150070;3.农业农村部水产品质量安全控制重点实验室，北京 100141;4.河北省水产技术推广总站，河北 石家庄 050021；5.东北农业大学，黑龙江 哈尔滨 150030;6.东北林业大学，黑龙江 哈尔滨 150006）

近年来随着我国养殖行业的迅猛发展，抗生素药物的使用规模也在随之增加[1]。氟喹诺酮类药物（FQs）对水产养殖中革兰氏阴性菌包括绿脓杆菌等，革兰氏阳性菌包括链球菌、葡萄球菌等均有较强活性[2]，具有高效、广谱、价格低廉、抗菌谱广等诸多优点[3]，目前已成为使用量较大的抗生素药物之一[4]。然而FQs 却难以被生物吸收或代谢，在自然界不易降解[5]。据研究表明，FQs 被动物体吸收后，仅有少部分的FQs 会残留在动物组织内，大部分会通过粪便或尿液等途径排出体外，最终进入到生态环境中，造成抗生素药物污染[6,7]。并且原药及其代谢产物会随食物链不断富集，最终影响与危害人体健康。综上所述，建立一种快速准确高效的检测渔业水环境中的FQs 残留的方法是十分有意义的。

固相萃取（SPE）因富集能力优良而被应用于不同的前处理过程[8,9]，但由于部分商业化固相萃取小柱的价格其应用受到相应的限制。磁性固相萃取（magnetic SPE，MSPE）是一种新型固相萃取技术，其采用磁性材料作为吸附载体，原理是将磁性吸附材料直接与待测样品溶液混合，通过振荡吸附等手段使得吸附材料和待测物充分接触并达到动态吸附平衡状态，再通过外部磁场作用将吸附了待测物的吸附材料与基质分离开，再采取洗脱等步骤解析待测物，达到富集目标待测物的目的。MSPE 技术萃取效率高、步骤简单、价格低廉、可批量处理大批次样品及可回收利用多次，已成为当前环境及食品安全等多个学科的研究热点如甘蓝中农药检测[10]，蜂蜜[11]、动物组织[12]和人体血液[13]中抗生素药物的检测等。

常用仪器检测法检测抗生素的残留量，如高效液相色谱（HPLC）法[14-17]和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法[18-20]等。由于HPLC 法的定性手段为保留时间，当基质相对复杂时会由于待测物与杂质同流出导致目标定性不准确，造成假阳性。而采用了三重四极杆质谱的多反应监测模式的LC-MS/MS法不仅仅通过保留时间，结合两对离子对及其比例，可以实现更准确的定性，还具有更高的准确度以及灵敏度，能够满足水环境中痕量抗生素药物残留检测的要求，目前为多组分检测的主要分析手段[21-24]。

本研究拟开发一种磁性萃取技术，以快速、准确检测养殖水体中FQs 的残留。选用碳纳米管作为载体，使用制备后具磁性的碳纳米管（MCNTs）作为渔业水环境中FQs 的吸附材料，结合超高效液相色谱串联质谱法，建立渔业水环境中多种FQs 的分离方法，最终建立水体中FQs 的残留检测方法。本方法具有灵敏度高、实验成本低、可同步批量检测等优点。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

液相色谱-串联质谱仪（ACQUITY UPLC-XEVO TQs，含ESI 电离源，美国Waters 公司）；空气压缩机（日立公司）；氮气发生器（PEAK 公司）；氮吹仪（N-EVAPTM111，美国Organomation 公司）；超声波清洗机（KQ-700E，昆山超声仪器有限公司）；纯水器（美国Millipore 公司）；涡旋混匀器（德国IKA 公司）；水浴锅；烘箱等。乙腈、乙醇、甲酸、碳纳米管（CNTs）、甲醇、氯化铁、氯化亚铁及氨水等试剂耗材购置于上海安谱实验室。

1.2 标准溶液配置

恩诺沙星（EFX）、环丙沙星（CFX），诺氟沙星（NFX）、培氟沙星（PEF）、洛美沙星（LOM）、氧氟沙星（OFX）、氟罗沙星（FLX）及三种内标NFX-D5、CFX-D8、EFX-D5 抗生素药物标准品均购自德国Dr.Ehrenstorfer 公司。准确称取一定量（10 mg）各标准品，加入甲酸0.2 mL，再加入甲醇超声溶解，定容于10 mL 容量瓶中，配制成1 mg/mL 的FQs 单标储备溶液，于-18℃保存。储备液用甲醇稀释，配制成各浓度的混合标准工作溶液，于4℃保存，现用现配。

1.3 样品前处理

磁性碳纳米管（MCNTs）根据本课题组已建立的合成方法做适当修改[25]。首先将CNTs 进行纯化，洗涤。进一步采用二价铁，三价铁在碱性条件下合成MCNTs。再经超纯水，无水乙醇分别清洗，烘干备用。取100 mL 水样过滤纸，收集滤液置于250 mL烧杯中。首先使用冰醋酸或氨水将过滤好的水样pH 调节到7，然后加入MCNTs 30 mg，涡旋30 s，振荡提取20 min。超强磁铁将MCNTs 吸附至底层，弃掉上层水样，而后每次使用1 mL 甲醇洗脱MCNTs，共计三次，磁性分离洗脱液，将洗脱液置于40℃下氮气吹至近干，加入1 mL 液相色谱初始流动相后涡旋30 s 混匀，过0.22 μm 有机相过滤膜得到上机液。

1.4 色谱质谱仪器条件

色谱相关条件如下：流速为0.3 mL/min；流动相A 为甲酸水溶液（V甲酸∶V水=1∶1000），流动相B 为乙腈；洗脱梯度程序为：0～2.0 min（保持95%A，5%B）；2.0～4.2 min（95%～5%A，5%～95%B）；4.2～6.4 min（保持5%A，95%B）；6.4～6.5 min（5%～95%A，95%～5%B）；6.5～8.0 min（保持95%A～5%B），其中流动相A 为0.1%甲酸水溶液（V甲酸∶V水=1∶1 000），流动相B 为乙腈。色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18，1.7 μm，2.1×50.0 mm；柱温为30℃。

质谱相关条件如下：电喷雾离子源（ESI+）；毛细管电压，3.0 kV；离子源温度，150℃；去溶剂温度，450℃；偏转电压，30 V；去溶剂气流量，800 L/Hr；锥孔气，250 L/Hr；锥孔电压，20 V；碰撞气流量，0.14mL/min；选择多反应监测（MRM）；FQs 的多反应监测模式各参数如表1 所示。以保留时间、离子对及离子对丰度比定性。定量采取内标法定量，其中NFX、OFX、FLX、PEF 选用NFX-D5 定量，CFX、LOM选取CFX-D8 定量，EFX 选取EFX-D5 定量。

表1 多反应监测模式下7 种FQs 的质谱参数Tab.1 Mass spectrometry parameters of seven fluoroquinolone antibiotics in multiple reaction monitoring mode

2 结果与分析

2.1 仪器分析条件的优化及确定

根据经典的色谱塔板理论，使用1.7 μm 粒径的5 cm 超高效液相色谱柱，相同长度的色谱柱会比传统的HPLC 有更好的柱效，并且在更短的时间内完成多组分物质的分离，得到更尖锐的色谱峰。优化LC-MS/MS 的MRM 方法和7 种氟喹诺酮类抗生素的质谱条件。配置每种FQs 物质标准品的单标溶液，采用Combine 方式得到其母离子及子离子的质核比。进一步优化碰撞能量等质谱参数。在MS SCAN 模式下得到待测物的母离子，然后在Daughter 模式下扫描得到相应子离子，找到两个丰度最高的子离子，其中一个母离子和一个子离子组成一对特征离子对。根据欧盟对化合物的定性要求，一般定性采用两对特征离子对，其中一对作为定量离子。为达到质谱的最佳灵敏度通过Combine 模式优化碰撞能量，以不同的碰撞能量扫描目标物的子离子，根据其强度的响应变化，得到最大响应值时的仪器参数。

2.2 萃取条件的优化

2.2.1 MCNTs 质量对回收率的影响

影响萃取最终回收率效率的因素有很多，其中MCNTs 的质量是关键因素之一。本实验在100 mL水样中分别加入10 mg、20 mg、30 mg、40 mg、50 mg磁性材料，每个实验组3 次平行，取平均值作图（图1-A），当MCNTs 添加量小于30 mg 时，7 种FQs 回收率同MCNTs 添加量成正相关；当添加量大于30 mg 后，FQs 回收率趋于稳定。因此最终选择向100 mL 水样中添加30 mg MCNTs 最为最优条件。

2.2.2 萃取时间的优化

在磁性固相萃取的诸多影响因素中，萃取时间对萃取效果的影响较为关键。此次实验考察了5 min、10 min、20 min、30 min、40 min 等不同萃取条件下回收率的变化规律，每个实验组做3 次平行试验，取平均值作图（图1-B），当萃取时间小于20 min时，吸附效果与萃取时间呈正相关，回收率提高；当萃取时间大于20 min 时，回收率变化不大，说明已达到萃取饱和状态。因此实验最终选择20 min 作为萃取时间。

图1 萃取剂添加量（A）、萃取时间（B）及使用次数（C）对FQs 回收率的影响Fig.1 The influence of amount of extractant（A）,extraction time（B）and frequency of use（C）on recovery of the fluoroquinolone antibiotics

2.2.3 洗脱剂的选择

本实验选取丙酮、甲醇和乙腈三种洗脱溶剂进行测试[25]。超声洗脱相对于涡旋洗脱会有更高的洗脱效率，选用3 mL 丙酮、3 mL 甲醇、3 mL 乙腈分别作为洗脱剂洗脱一次（超声30 s），发现甲醇洗脱剂洗脱效果良好，价格较低。另外，选取合适的洗脱体积会减少后续氮气吹干所需的时间，实验选用了1 mL、3 mL 及5 mL 等不同体积的洗脱剂进行实验，结果表明当洗脱剂为1 mL 甲醇，每次超声30 s，重复上述操作2 次，每个组份的回收率均可以达到80%以上。故最终选取甲醇1 mL 作为洗脱剂。

2.2.4 MCNTs 的重复使用

磁性分离后，将MCNTs 回收，重新干燥待用。并重新使用回收干燥后的MCNTs 作为吸附材料重新处理样品，并在最优条件下测定其回收率，每个实验组做3 次平行试验，取平均值作图（图1-C），使用MCNTs 第3 次时，待测物回收率依然可以达到75.67%以上。故此吸附材料可重复使用至少2 次。

2.3 方法线性范围及检出限

分别配制不同浓度梯度的FQs 标准溶液100 mL，按照上述优化后得到的最佳前处理条件净化富集样品，最后采用UPLC-MS/MS 定性定量分析。结果显示，在样品质量浓度在20～1 000 ng/L 范围时得到了很好的线性，其相关系数r 均在0.995～1 之间，检出限为10.0 ng/L。为了考察方法的准确性，选取了低浓度（10 ng/L）、中浓度（100 ng/L）和高浓度（1 000 ng/L）3 个不同浓度对质控样品进行加标回收实验，且每个浓度做三次平行试验，以纯净水的加标回收率进行校正，测定加标回收率，将高浓度质控样品连续处理三天计算回收率以得到日间精密度。七种FQs 的回收率均在76.70%～98.16%之间，日内精密度在2.21%～5.39%之间，日间精密度在3.48%～6.21%之间（表2）。

表2 七种FQs 的加标回收率及精密度Tab.2 Recoveries and precision of the fluoroquinolone antibiotics in fishery water

2.4 实际样品分析

实际水样取自4 个位于哈尔滨周边的养殖池塘（各1 个样品）、哈尔滨市道里区室内自来水（1 个样品）和某品牌瓶装矿泉水（1 个样品），共计6 个样品。经上述前处理过程后分析，发现哈尔滨一处池塘有恩诺沙星（EFX）和环丙沙星（CFX）的残留，其EFX 含量为90.62 ng/L，CFX 含量为27.51 ng/L（图2）。

图2 空白（A）、标准样品（B）和实际样品（C）色谱图，其中箭头指示部分为EFX 和CFX 的两个定性离子对的放大色谱图Fig.2 The total ion chromatogram of（A）the blank sample;（B）the standard fluoroquinolone antibiotics;and（C）one real sample,where the arrows indicated the extraction ion chromatogram

3 讨论

本方法相比于采用商业固相萃取柱方式前处理样品，可以降低实验成本[23]。并且较先前课题组建立的筛查方法本研究得到了更好的定量限，使定量限进一步降低1.65 倍[26]。在仪器分析阶段，采用液相色谱作为分离单元分离多组份时往往需需要20 min 以上；本研究采用超高效液相色谱可以将分析时间控制在8 min，缩短为分析时间一半以上，同时每分析一个样品仅需要不到1.03 mL 有机流动相，每个样品可减少消耗1.6 mL 有机溶剂[27]。在处理样品时可以采用同步振荡方式处理大批量渔业水环境样品，提高检测效率，具有操作简单用时短、环保安全等优点[25]。

综上所述，本实验建立了一种新型分离萃取渔水域中七种氟喹诺酮类药物的M-SPE 方法，采用UPLC-MS/MS 对FQs 定性定量分析。针对色谱质谱条件、吸附材料的质量、萃取时间、洗脱剂的选择等条件进行了优化，所分析的诺氟沙星（NFX）、环丙沙星（CFX）、培氟沙星（PEF），洛美沙星（LOM）、恩诺沙星（EFX）、氧氟沙星（OFX）、氟罗沙星（FLX）七种FQs 在20～1 000 ng/L 表现出良好的线性，具有实验成本低、检测灵敏、仪器分析时间短、节约有机溶剂消耗及可批量处理等优势。未来亦可制作成商品化样机，应用于实际渔业水环境样品的现场处理，以解决现场快检技术中样品前处理的瓶颈，具有很好的应用前景。