药典法测定黄芪药材黄芪甲苷含量方法的商榷

★ 肖柳君 吕尚 魏惠珍,2 金浩鑫 杨磊 丁若雯 丁平平 饶毅,2（.江西中医药大学 南昌 330004；2.中药固体制剂制造技术国家工程研究中心 南昌 330006）

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.Var. mongholicus(Bge.) Hsiao 或膜荚黄芪A.membranaceus(Fisch.) Bge 的干燥根，具有补气固表、利水消肿、敛疮生肌功效［1］。黄芪甲苷属于羊毛酯型四环三萜皂苷类化合物，具有调节免疫、抗炎、抗肿瘤等作用［2-3］，含有黄芪的中医经典名方及复方制剂均把黄芪甲苷作为质量控制的关键成分［4-5］。《中国药典》2015 年版黄芪药材中黄芪甲苷含量测定采用D101 大孔树脂进行处理，高效液相-蒸发光散射检测法进行定量分析。通过对D101 大孔吸附树脂洗脱流速、10 种D101大孔吸附树脂泄漏曲线进行考察，以及对索氏回流后药材残渣进行含量测定，结果发现在供试品的制备过程中洗脱流速、D101 大孔树脂的选择、提取方式等问题值得商榷。另外，鉴于黄芪甲苷不达标率较高，重复性差［6-7］，笔者借鉴黄芪薄层鉴别方法，采用中性氧化铝柱层析方法纯化黄芪药材。通过考察D101 大孔吸附树脂与中性氧化铝柱层析两种不同制样方法对黄芪样品中黄芪甲苷含量的影响，为往后更合理地控制黄芪药材的质量奠定基础。

1 材料

1.1 仪器

Waters 2695-2996 高效液相色谱仪（ELSD2000检测器）；梅特勒AB-104N 万分之一电子天平；SHIMADZU AUW220D 十万分之一电子分析天平；Milli-Q 超纯水机（美国Millipore 公司）。

1.2 试药

黄芪甲苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号110781-201717，纯度为96.9%）；D101 大孔树脂（河北、江苏等）；中性氧化铝（国药集团＜100～120 目/100～200 目/200～300 目＞、上海陆都、上海缘江）；乙腈（色谱纯，美国TEDIA）；甲醇（分析纯，广东光华科技股份有限公司）；甲酸（分析纯，上海化学试剂有限公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水（35∶65）；柱温30 ℃；ELSD 参数：漂移管温度为102 ℃，气体流速为3.0 L/min，增益值为1.0。分别精密吸取对照品溶液10 μL 和20 μL，供试品溶液20 μL，注入液相色谱仪测定，用外标两点法计算供试品溶液含量。

2.2 对照品溶液的制备

取黄芪甲苷对照品粉末约12.09 mg，精密称定，加甲醇溶解于25 mL 容量瓶中，得黄芪甲苷对照品浓度为0.468 6 mg/mL。

2.3 供试品溶液制备方法

方法1（药典方法）：参照《中国药典》2015年版黄芪药材项下黄芪甲苷含量测定方法［1］。

方法2（改进方法）：取黄芪药材中粉约6 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密量取甲醇50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25 mL 通过中性氧化铝柱（100～120 目，5 g，内径为1.5 cm），用40%甲醇150 mL 洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水30 mL 使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4 次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2 次，每次40 mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，即得。

2.4 对方法1（药典方法）进行考察

2.4.1 对D101 大孔吸附树脂洗脱溶剂洗脱流速单因素考察照方法1 项下的方法，从“残渣加水5 mL 使溶解”起，放冷后的样品通过D101 大孔吸附树脂柱，通过把洗脱溶剂洗脱速率控制在1.4 mL/min，样品在70%乙醇段80 mL 才能勉强全部洗脱完全；当大孔吸附树脂洗脱流速为4.1 mL/min，70%乙醇80 mL 并不能使黄芪甲苷洗脱完全，经进一步洗脱发现还有约4%的黄芪甲苷残存在大孔吸附树脂中；当大孔吸附树脂洗脱流速增大到6.9 mL/min，黄芪甲苷含量损失达到14%。见表1。

表1 不同洗脱速率对大孔吸附树脂洗脱黄芪甲苷实验结果

2.4.2 D101 大孔吸附树脂泄漏曲线考察照方法1 项下的方法，自“残渣加水5 mL 使溶解，放冷”起，样品分别通过10 种D101 大孔吸附树脂。先用40%乙醇30 mL 分3 次洗脱，每次10 mL，继而用70%乙醇110 mL 分11 次洗脱，每次10 mL，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解定容至5 mL，依次进样。通过对10 种D101 大孔树脂进行泄漏实验，可以发现泄露曲线存在差异，部分D101 大孔吸附树脂洗脱，弃掉的40%乙醇30 mL 中也存在黄芪甲苷，70%乙醇80 mL 并不能把黄芪甲苷洗脱完全。潘细贵等［8］通过实验已证明，采用D101 大孔吸附树脂净化除杂黄芪药材，使用低浓度乙醇（15%）处理，也能洗脱部分黄芪甲苷，并随着浓度的增大而增大，同时D101 大孔吸附树脂对黄芪总皂苷存在一定的死吸附。曹庆伟等［9］使用不同厂家D101大孔吸附树脂纯化黄芪药材回收率存在较大差异，均与本实验结果相一致。见图1。

图1 大孔树脂吸附黄芪甲苷梯度泄漏曲线

2.4.3 对索氏提取器中回流后的药材残渣进行考察为探究按照《中国药典》方法索氏回流提取样品是否提取完全，对提取结束后所得黄芪药材残渣按照方法2 从“加热回流1 h”起进行操作。实验测定发现，索氏提取后的残渣中至少还有10%的黄芪甲苷，说明黄芪药材经索氏提取并不能提取完全，按方法1 测定黄芪甲苷含量，会使黄芪药材中黄芪甲苷含量偏低，与文献报道相一致［10］。见表2。

表2 索氏提取后黄芪药材残渣中黄芪甲苷含量测定结果%

2.5 方法2 方法学考察

2.5.1 标准曲线的制备取浓度分别为0.234 3，0.468 6，0.562 3，0.702 9，0.937 2，1.171 5 mg/mL的黄芪甲苷对照品溶液进样，以对照品峰面积的常用对数值（Y）为纵坐标，以黄芪甲苷浓度的常用对数值（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程为Y=1.667 5X+6.288 2（r=0.999 4），结果表明，黄芪甲苷在0.234 3～1.171 5 mg/mL呈良好的线性关系。

2.5.2 精密度试验取2.2 项下的对照品溶液（0.468 6 mg/mL）连续进样6 次，每次进样20 μL，测定峰面积，计算RSD为1.05%。

2.5.3 重复性试验取同一批黄芪药材粉末按方法2 平行制备6 份供试品溶液，计算其结果。结果可知，黄芪甲苷的含量为0.1%，RSD为0.49%，即样品的重复性良好。

2.5.4 稳定性试验依照方法2 制备样品一份，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h 进样，每次进样20 μL，依法测定记录峰面积。计算可得黄芪甲苷的峰面积RSD为1.49%，表明样品在12 h 内稳定。

2.5.5 加样回收试验取“重复性试验”项下黄芪药材粉末3 g 精密称定，平行称取9 份，分别精密加入浓度为1.171 5 mg/mL 对照品溶液2.1、2.6、3.2 mL,按照方法2 制备方法制得加样回收供试品溶液。黄芪甲苷加样回收率实验结果见表3。

表3 黄芪药材黄芪甲苷加样回收试验

2.5.6 系统耐用性采用Dikma、Kromasil、Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱对2.2 项下的对照品溶液（0.468 6 mg/mL）分别连续进样6 次，每次进样10 μL，黄芪甲苷峰面积RSD分别为1.25%、1.01%、0.98%。实验说明色谱柱不会影响含量测定的结果，因采用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱出峰时间最快，故选择它进行黄芪甲苷含量测定。

2.6 不同批次黄芪药材含量测定

取8 批不同来源的黄芪药材照“方法1”与“方法2”制备供试品溶液，测定结果见图2 和表4。

表4 两种方法测定黄芪甲苷含量结果比较 %

图2 HPLC图谱

3 讨论

方法1 来源于药典方法，方法2（改进方法）借鉴黄芪药材薄层鉴别方法。两种方法的区别包括以下几点：（1）样品前处理时间不同，改进方法处理样品的时间约6.5 h,原方法处理样品的时间＞12 h，改进方法处理样品的时间更短，节约时间。（2）提取效率不同，改进方法采用加热回流，提取时间仅1 h，而原方法采用索氏提取，时间为4 h，提取时间大大缩短。（3）洗脱溶剂不同，改进方法只需用50%甲醇处理，而原方法需要经过水、40%乙醇、70%乙醇依次洗脱，改进方法洗脱溶剂更简单。（4）可重复性不同，改进方法可重复性好，原方法可重复性差。

通过对D101 大孔树脂进行考察，发现大孔吸附树脂在洗脱过程中极易产生气泡［11］，洗脱流速需控制在约1.4 mL/min 才能对黄芪甲苷较好洗脱，《中国药典》2015 年版对此并没有给出具体的量化参数。其次，采用D101 大孔吸附树脂纯化黄芪药材，药典法只测定70%乙醇80 mL 段洗脱液中黄芪甲苷含量。本实验通过对10 种D101 大孔吸附树脂进行泄漏曲线考察可知，在一定程度上，70%乙醇80 mL 段所测结果并不能代表黄芪药材中黄芪甲苷总含量。此外，采用索氏回流与加热回流两种提取方式对黄芪药材进行考察，索氏回流并不能提取完全。中性氧化铝主要适用于亲脂性成分的分离，不少药品标准采用中性氧化铝柱层析方法对甾体类化合物、生物碱、强心苷、内酯类化合物进行定性定量分析［12-13］。笔者通过对不同生产厂家与不同目数的中性氧化铝进行考察，所得黄芪甲苷含量均比药典方法高一倍左右。

综上所述，与药典法相比较，方法2是一种简便、易行的测定黄芪药材中黄芪甲苷含量的方法，为快速、准确的测定黄芪甲苷含量提供了一种新思路。