不同产地大黄药材中13 种活性成分含量测定及其HPLC-FP 研究

★ 孟岩 李焐仪 单家明 陈海芳 黄小英 杨明 杨武亮（江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室 南昌 330004）

小承气汤出自于张仲景的《伤寒论》，由大黄、厚朴、枳实三者组成［1］，具有轻下热结，除满消痞之效，常用于阳明腑实轻证。方中君药大黄源于蓼科植物掌叶大黄（Rheum palmatumL.）、唐古特大黄（Rheum tanguticum Maxim.exBalf.）或药用大黄（Rheum oきcinaleBaill.）的干燥根和根茎，是我国常用大宗中药，具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄等功效［2］，临床上主要用于消化系统、急腹症、免疫系统等疾病的治疗［3］。《景岳全书》中云：“人参、熟地、附子、大黄为药中之四维……大黄者乱世之良将也”［4］。作为“药中将军”，大黄历来为医学名家所推崇，自《金匮玉涵经》以后的本草医籍大多可见关于大黄不同炮制品应用的记载［5］。据陈嘉倩等［6］统计结果可知，现存含有大黄的古方共有7 226 首，其中不乏功效显著的经典名方，包括小承气汤在内，目前已有5 首被录入《古代经典名方目录（第一批）》［7］。

经典名方由于具有应用广泛，疗效确切等显著优势，当下已成为中药研发的热点。质量是中药的生命线，为生产出质量均一稳定的经方制剂，首先需要确保药材及饮片资源质量及供给的稳定性［8］。作为典型的多产区药材，大黄在甘肃、青海、云南及四川等地均有分布，由于受地域、环境、气候等因素的影响，各产区的大黄药材化学成分的组成及含量均有一定差异［9-10］，导致药材质量参差不齐，不同品种及不同来源的药材之间是否可以等质替换还有待考证。传统性状鉴别及理化鉴别方法均有一定局限性［11］，难以准确反应药材之间的内在质量差异，因此，需要建立一种科学合理的鉴别方法，对不同产地的大黄药材进行区分。现代研究表明，大黄中主要含有蒽醌类、蒽酮类、二苯乙烯类、苯丁酮类、鞣质类等化学成分［12］，具有泻下、抗病毒、抗炎等药理作用［13］，其中发挥泻下作用的主要活性成分为结合蒽醌类，游离蒽醌主要作用为抗菌消炎［14-15］。本研究采用HPLC 法测定大黄药材中8 种结合蒽醌和5 种游离蒽醌活性成分的含量，采用2012 版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（V2.0，国家药典委员会）对其进行相似度评价，并运用SPSS 21 软件对色谱数据进行聚类分析，以期探明不同产地大黄药材内在活性成分含量差异，为大黄药材产地的准确区分和资源的合理利用提供依据，同时为经典名方小承气汤物质基准研究提供合格的药材与饮片。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪（包括四元泵、在线脱气机、自动进样器、DAD 检测器和色谱工作站）；万分之一电子天平（型号：BT 224 S，北京赛多利斯科学仪器有限公司）；十万分之一电子天平（型号：BT 25 S，北京赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.2 药材与试剂

芦荟大黄素（批号：110722-201815）、大黄酸（批号：110721-201818）、大黄素（批号：111857-201703）、大黄酚（批号：110796-201621）、大黄素甲醚（批号：110758-201616）、掌叶大黄对照药材（批号：121249-201304）均购于中国食品药品检定研究院；芦荟大黄素-8-O-β-葡萄糖苷（批号：PS1497）、芦荟大黄素-3-（羟甲基）-O-β-D-葡萄糖苷（批号：PS1495）、大黄酸-8-O-葡萄糖苷（批号：PS1697）、大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷（批号：PS1506）、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷（批号：PS1507）、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷（批号：PS1508）、大黄素甲醚-1-O-β-D-葡萄糖苷（批号：PS1524）、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷（批号：PS1521）均购于成都普思生物科技股份有限公司，含量HPLC 归一化均为98%；甲醇（色谱纯），水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。大黄药材由江西仁和药业有限公司提供，经江西中医药大学赖学文教授鉴定。见表1。

表1 样品来源

2 方法与结果

2.1 大黄药材供试品溶液的制备

取大黄药材粉末（过4 号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL 并称重，水浴回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45 μm 膜滤过，取续滤液，即得。

2.2 混合对照品的制备

分别称取减压干燥至恒重的“1.2 项下”各对照品适量，精密称定，分别置容量瓶中配制成母液；再精密吸取上述各对照品母液适量，置于50 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得含芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷66.89 μg/mL、大黄酸-8-O-葡萄糖苷18.75 μg/mL、大黄酚-1-Oβ-D-葡萄糖苷40.80 μg/mL、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷103.68 μg/mL、芦荟大黄素-3-（羟甲基）-O-β-D-葡萄糖苷43.65 μg/mL、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷24.96 μg/mL、大黄素甲醚-1-Oβ-D葡萄糖苷33.90 μg/mL、大黄素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷20.70 μg/mL、芦荟大黄素21.87 μg/mL、大黄酸17.73 μg/mL、大黄素22.38 μg/mL、大黄酚19.02 μg/mL 和大黄素甲醚15.93 μg/mL 的混合对照品溶液，备用。

2.3 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18柱（150 mm× 4.6 mm, 5 μm）；流动相：A 为甲醇，B 为磷酸水（pH=3）梯度洗 脱，0 min，A：20%，0～60 min，A：20%～90%，60～70 min，A：90%～100%；流速：1 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：25 ℃；进样量：5 μL。在上述色谱条件下，测定各成分的含量。见图1。

图1 大黄药材HPLC含量测定色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度实验精密吸取“2.2 项下”制备的混合对照品溶液5 μL，按“2.3 项下”方法连续进样6 次，记录各成分的峰面积，分别计算RSD值，结果表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验取32 号大黄样品共5 份，每份约0.5 g，精密称定，按 “2.1 项下”方法制备供试品溶液，按 “2.3 项下”色谱条件测定，分别计算上述13 个成分含量的RSD，结果表明方法重复性较好。

2.4.3 稳定性试验取32 号大黄药材供试品溶液，按“2.3 项下”，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样，记录上述13 个成分的峰面积，分别计算其RSD，结果表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.4.4 加样回收率实验取已知各成分含量的32号大黄药材粉末（过四号筛）约0.25 g，平行6 份，精密称定，分别加入混合对照品溶液适量，按“2.1项下”方法制备供试品溶液，按“2.3 项下”色谱条件进样，计算上述13 个成分的平均回收率及其RSD。见表2。

表2 含量测定方法学考察实验结果 %

2.4.5 线性范围考察分别精密吸取按“2.2 项下”方法的混合对照品0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL分别置于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，静置，即得系列对照品溶液。按“2.3 项下”色谱条件，分别进样10 μL 测定峰面积。以对照品的量（ng）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。见表3。

表3 13个蒽醌类成分的回归方程及线性范围 ng

2.5 样品测定

取不同产地的大黄药材，按“2.1 项下”方法制备供试品溶液，精密吸取5 μL，按“2.3 项下” 色谱条件进样，记录色谱图，将上述13 个成分的峰面积代入回归方程，分别计算各成分含量。由于同一产地不同批次药材之间含量存在一定差异，故计算各个产地的平均含量。结果显示甘肃不同产地之间化学成分含量差异不大，表明甘肃产大黄药材质量相对稳定；而四川、重庆、湖北、青海等地产大黄药材中13 个成分含量与甘肃产有一定差异。见表4。

表4 不同产地大黄药材中13个蒽醌类成分含量（n=3） %

2.6 指纹图谱测定与相似度评价

2.6.1 指纹图谱测定分别取62 批大黄药材样品及大黄（掌叶大黄）对照药材，按“2.1 项下”方法制备供试品溶液，按“2.3 项下”色谱条件测定，记录色谱图。将上述供试品色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”软件，以对照药材指纹图谱作为参照，经多点校正和自动匹配生成大黄药材指纹图谱共有模式，62 批大黄药材HPLC 指纹图谱见图2，大黄（掌叶大黄）对照药材图谱见图3。

图2 62批大黄药材指纹图谱

图3 掌叶大黄对照药材图谱

2.6.2 相似度分析采用2012 版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（V2.0，国家药典委员会）软件对上述数据进行处理。见表5。62 批大黄药材指纹图谱与对照药材图谱相似度范围为0.576～0.965，说明不同产地之间大黄药材的质量存在一定差异。除S9 外，甘肃各地产大黄药材指纹图谱与对照药材指纹图谱相似度均大于0.85，表明甘肃产大黄药材质量较稳定；四川、湖北、重庆及青海等地产大黄药材指纹图谱与对照药材指纹图谱相似度范围分别为0.749～0.822、0.772～0.783、0.765～0.817、0.576～0.753，表明四川、重庆、湖北等地产大黄药材质量相近，与甘肃产有一定差异；青海产大黄药材质量与甘肃产差异较大。

表5 62批大黄药材相似度分析结果

（续表）

2.7 系统聚类分析

聚类分析又称集群分析, 它是研究“物以类聚”的一种数理统计方法，可将观察对象依据某些数量特征加以归类，在现今中药质量控制，品种分类等方面被广泛使用［16］。本研究以14 号峰为参照峰，计算62 批不同产地大黄药材指纹图谱共有峰的相对峰面积，将其导入SPSS 21.0 软件，采用组间连接法，以卡方距离为测度对样品进行聚类分析。如图4 所示，当卡方距离为10 时，62 批大黄样品可分为5 类，第1 类包含S42～S55 和S61、S62，即四川、重庆及湖北等地产大黄药材被聚为一类；S56～S59为第2 类，即青海产大黄药材；S1～S41 为甘肃产大黄药材，其中S9 单独分为第3 类，其余样品分为第4 类和第5 类。从分类结果可看出，甘肃不同产地大黄药材的分类存在着产地相互交叉的现象，四川、湖北及重庆产大黄药材可与甘肃及青海产大黄药材区分开。聚类分析结果与相似度分析结果基本一致。

图4 62批大黄药材系统聚类分析树状图

3 讨论

本实验对不同提取方法（超声提取、加热回流提取）、提取溶剂（乙醇、甲醇、70%甲醇）、提取时间（30、60、90 min）、溶剂量（25、50 mL）等因素进行考察，从提取的全面性、稳定性及操作便捷性等方面考虑，确定最佳提取条件为0.5 g 药材粉末加50 mL 甲醇，水浴回流60 min。

实验中比较了甲醇-水（冰乙酸调pH=3）、甲醇-水（磷酸酸调pH=3）、乙腈-水（冰乙酸调pH=3）3 种不同的流动相，结果表明以甲醇-水（磷酸调pH=3）为流动相进行梯度洗脱时，分离效果较好，特征峰明显，整体基线较平稳；对254、283、296、330、360 nm 等不同波长进行考察，发现在254 nm 波长下，图谱信息较为全面，各峰响应值较高，故选择254 nm 作为检测波长；考察了20 ℃、25 ℃、30 ℃时柱温对分离度的影响，结果在25 ℃条件下，分离度较好。

本实验运用HPLC 色谱法同时测定了62 批大黄药材中13 个蒽醌类化合物的含量，并对其指纹图谱进行研究，实验中共选用了两个品种的大黄，其中甘肃产大黄为掌叶大黄，四川、重庆、湖北、青海产大黄均为药用大黄。从含量测定结果可看出，甘肃各产地大黄药材中化学成分含量接近，与四川、重庆、湖北、青海产大黄有一定差异，相似度分析及聚类分析结果也将甘肃产大黄归为一类，与其它省份大黄区分开。上述实验结果表明甘肃产大黄质量较稳定，且掌叶大黄与药用大黄之间有明显的质量差异，因此在经方制剂生产过程中，两种大黄药材不宜等质替换。S9 为礼县大黄，与礼县其它批次药材质量差别较大（相似度为0.709），且聚类分析单独分为一类，推测可能是由于取样部位不同导致的个体差异［4］。

经典名方作为中医理论的载体，临床治病的主要方法，事关中医的理法方药体系、临床应用以及产业振兴，是实现中医药传承创新发展的关键［17］，中药材是中医防病治病的物质基础，其质量的优劣直接影响经方疗效的好坏。当前我国中药市场较为混乱，以假乱真，以次充好，非法加工等现象较为普遍［18］，为改善这一现状，政府机构除加大对中药材及中药饮片市场的指导及监管力度，提高从业人员业务素质及道德水平外，还应进一步完善中药材的质量控制体系。本实验建立多成分定量与指纹图谱相似度分析、聚类分析相结合的方法，用以初步评价不同品种及不同产地大黄药材间的质量差异。建立的方法简便、准确、可靠，不仅可为大黄药材的分类、品质分析及完善其质量控制标准提供依据，也可为经典名方小承气汤物质基准的成功研制提供保障。