基于网络药理学探讨黄芪-当归治疗糖尿病足的作用机制

牛文晶， 刘 鹏， 王 军

糖尿病足（diabetic foot ulcer, DFU）具有发病率高、致残率高、致死率高、治愈率低的特点。据统计糖尿病患者一生中发生足溃疡的风险为25%[1]，溃疡如不能及时愈合则形成慢性创面，甚至会导致截肢[2]。糖尿病足在祖国医学中属于“脱疽”范畴，具有“本虚标实、毒浸迅速、腐肉难去、新肌难生”的特点，气血瘀滞、经脉阻塞为主要病机[3]。课题组在充分认识及多年临床辨证基础上，创立“丹黄消炎方”，能促进糖尿病足脱腐排脓、生肌长皮，有效缩小创面，促进愈合，有效改善创面感染情况[4-5]。方中黄芪扶正补益气血，当归活血养血，令气血运行，祛瘀生新，共奏“扶正活血”之效。本文采用网络药理学方法，初步探讨黄芪-当归（huangqi-danggui，HQ-DG）促进糖尿病足溃疡愈合可能的分子机制，挖掘黄芪-当归主要化合物成分及作用靶点，并对预测靶基因进行生物功能分析，构建化合物蛋白通路网络，为后续复方机制研究及扩展临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 活性成分的收集 通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）以口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18为筛选条件，结合国内外文献获取黄芪-当归的活性成分信息。

1.2 靶点的预测与筛选 通过TCMSP获得黄芪-当归活性成分的作用靶点蛋白，查阅相关文献，对未纳入的已知靶点进行补充。将其导入UniProt数据库进行名称标准化，导出后标记为“药靶点”。以“diabetic foot ulcer”“diabetic foot” 为 关 键词，检索 GeneCards（https://www. genecards.org）、OMIM（https://omim.org）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd） 和 DurgBank（https://www.drugbank.ca）数据库获得疾病相关靶点，将4个数据库疾病靶点合并后删除重复值，标记为“病靶点”，并与药物靶点蛋白取交集。

1.3 蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建 将所得药物-疾病交集靶点上交至STRING（https://string-db.org）数据库构建PPI网络，将生物种类设定为人类，将interaction score设定为0.99。通过Cytoscape 3.7.2软件中cytoHubba 插件获得黄芪-当归治疗糖尿病足的核心靶点。

1.4 GO富集与KEGG通路分析 基因本体（geneontology，GO）富集分析与京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopediaof genes and genomes，KEGG）通路分析将黄芪-当归治疗糖尿病足的靶点输入Metascape平台（https//www.metascape.org），将生物种类设定为人类，设置P＜0.001，进行GO富集分析和KEGG通路分析，保存数据并进行可视化处理。

1.5 “药物-有效成分-靶点-通路”网络的构建将黄芪-当归活性成分、潜在靶点与疾病通路富集分析结果进行映射，导入Cytoscape软件，构建“药物-成分-靶点-通路”网络图。

2 结果

2.1 黄芪-当归活性成分及靶点的获取 黄芪活性成分的初步获取有87个，当归125个，根据生物利用度(OB)、类药性（DL）这两个ADME属性设置，最终筛选后获得黄芪的活性化合物20个，主要有丁子香萜、异鼠李素、异微凸剑叶莎醇、山柰酚等；当归2个，主要为β-谷固醇/植物甾醇、豆甾醇。见表1。黄芪对应成分靶点202个，当归对应成分靶点52个，将黄芪-当归主要化合物的作用靶点取并集并删除重复值后，共得到主要作用靶点212个。

表1 黄芪-当归化学成分

续表2

2.2 糖尿病足的疾病相关靶点获取 以“diabetic foot ulcer” 及“diabetic foot” 检 索 Genecards数据库获得疾病靶点2 467个，将Score设置为大于中位数为糖尿病足的潜在靶点，同样方法检索OMIM数据库获得疾病靶点95个，结合TTD、DRUGBANK数据库进行补充，将以上靶点数据合并后删除重复值，最终得到1 306个糖尿病足溃疡相关靶点。

2.3 黄芪-当归与糖尿病足交集靶点PPI网络的构建 将最终筛选的黄芪-当归活性成分作用靶点，即“药靶点”与糖尿病足疾病靶点，即“病靶点”，取交集，获得二者共同靶点118个，用韦恩图表示，见图1。将共同靶点导入至 STRING11.0平台，获得“黄芪-当归与DFU交集靶点”PPI网络，见图2。将PPI网络导入CytoScape3.7.1中，运用cytoHubba插件，通过对网络结构和节点间加权重联系的算法分析筛选出hub节点基因，见图3。

图1 黄芪-当归(HQ-DG)与糖尿病足的交集靶点

图2 黄芪-当归-糖尿病足的交集靶点PPI网络图

图3 黄芪-当归与糖尿病足交集靶点的节点基因

2.4 靶点功能与通路的富集分析 应用Metascape数据平台对黄芪-当归治疗糖尿病足相关靶点进行信号通路分析并对结果可视化。GO-BP富集提示黄芪-当归主要参与伤口愈合、对有毒物质的反应、调节细胞凋亡、迁移、增殖、活性氧代谢等生物过程。GO-CC提示靶点分子富集于分子细胞-底物黏附物的连接点、质膜蛋白及受体复合物、细胞外基质等。GP-MF提示靶点分子可实现与转录因子、细胞因子、生长因子受体、蛋白质结构域、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶等激酶或蛋白酶结合等功能，见图4。KEGG富集到347条通路，前20条显示黄芪-当归主要参与patuway in cancer、AGERAGE singaling pathway in diabetic complications、Fiuid shear stress and atherosclerosis等。见图5。

图4 黄芪-当归主要成分潜在靶点的富集分析

图5 靶点通路的富集气泡图

2.5 “药物-有效成分-靶点-通路”网络的构建利用Cytoscape软件，导入包括黄芪-当归活性成分、黄芪-当归与糖尿病足交集靶点、富集通路映射结果的excel表格，及excel属性表，构建“药物-有效成分-靶点-通路”网络图。见图6。

图6 黄芪-当归治疗DFU的“药物-成分-靶点-通路”网络图

3 讨论

创面愈合是人体内最复杂的组织修复过程之一。正常的伤口愈合是通过一系列顺序的、重叠的阶段发生的，包括止血、炎症、增殖和重塑[6]。高糖状态扰乱了伤口愈合的正常级联，导致糖尿病足溃疡经久不愈。近年来，中医药治疗糖尿病足，促进溃疡愈合引起广泛研究。本次采用网络药理学方法筛选出黄芪-当归治疗糖尿病足，促进溃疡愈合涉及的主要化学成分有22个，包括丁子香萜、异鼠李素、山柰酚、β-谷固醇、豆甾醇等，符合中药多成分作用特点。GO富集结果提示黄芪-当归作用于靶点分子，可实现与转录因子、生长因子受体、蛋白质结构域、激酶/蛋白酶结合，参与溃疡愈合各时期趋化因子、细胞因子、炎症细胞等的释放与募集、内皮细胞、成纤维细胞的迁移增殖、细胞外基质合成等生物过程。已有文献证实黄芪-当归主要活性成分可修复血管内皮细胞氧化损伤，且在抗炎、调节免疫功能等方面也发挥作用[7-8]。

细胞因子之间的平衡被打乱是溃疡愈合延迟的重要原因[9]。糖尿病足溃疡大鼠模型血清及创面炎症因子、趋化因子表达偏高而生长因子表达不足[10-11]，本次运用CytoScape3.7.1中cytoHubba插件获得黄芪-当归与糖尿病足相关的118个交集基因的hub节点，包括基质金属酶（MMP）-9、血管内皮细胞生长因子A(VEGFA)、肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6、CXCL8等，提示黄芪-当归治疗DFU是通过调控这些关键基因发挥作用的。调控糖尿病溃疡大鼠创面组织中MMP-9等因子表达水平改善胶原蛋白过度降解,维持细胞外基质代谢平衡,可促进创面愈合[12]；VEGFA是VEGF家族主要成员，具有高度内皮细胞特异性的有丝分裂原，是创面愈合过程中最主要的促血管生成因子，在血管发生和形成过程中起着主要的调控作用[13]； IL-6作为白细胞介素家族一员，在感染和组织损伤后迅速产生，可通过抑制自噬增加血管内皮细胞凋亡，使组织修复能力下降，IL-6持续合成失调或活性降低在慢性炎症中有重要病理作用[14]；CXCL8是最重要的促炎趋化因子之一，单体和二聚体状态的CXCL8都能够识别并与CXCR2结合，激活下游信号并参与人体复杂的炎症反应调控[15-16]。TNF-α通过激活T细胞、B细胞和巨噬细胞来调节免疫系统，从而诱导其他细胞因子和细胞黏附分子的表达。此外，TNF-α具有间接的促血管生成作用，TNF-α调节失调也与多种人类炎性疾病有关[17]。部分节点在糖尿病足领域研究较少，且黄芪-当归调控关键靶点的机制也有待进一步探讨与验证。

KEGG富集相关结果可知黄芪-当归通过调控AGE-RAGE糖尿病并发症信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、PI3K-AKT信号通路等多条途径治疗糖尿病足，促进溃疡愈合。AGE-RAGE糖尿病并发症信号通路是DFU愈合过程的重要通路。持续高血糖状态下，组织基质和细胞内累积了大量的晚期糖基化终产物(AGEs），产生多种不同的细胞内毒素和组织基质蛋白之间不适当的交联。AGE-RAGE信号通路中受体与配体的结合产生的促炎细胞因子、趋化因子和细胞黏附分子，改变了固有免疫和适应性免疫反应，引发组织的氧化应激、炎症、血栓、纤维化反应等，导致持续和侵袭性炎症反应和免疫抑制，加剧AGEs对多器官系统的有害作用，延迟溃疡愈合[18]。黄芪多糖有效降低糖尿病足溃疡成纤维细胞中AGEs累积浓度及RAGE mRNA的表达，促进糖尿病足溃疡愈合；当归通过调控缺氧诱导因子（HIF）-1α mRNA及蛋白表达，促进血管生成[19-20]。

早在1999年就有研究小组提出了中医综合征与生物分子网络相关的假设，还发现了生物分子网络与冷热综合征之间的相互联系；2011年，“网络靶点”概念的提出，在生物分子网络水平上阐明了医学对疾病综合征的系统调控；在此前提下，网络药理学不断发展，提出了基于网络靶点的系统分析方法，包括生物分子网络的构建、网络靶点分析方法、药物作用机制的网络靶点分析和网络靶点的验证[21-23]。

本研究正是利用网络药理学从系统和整体的角度来衡量药物对生物分子网络的调控作用。通过TCMSP数据库检索发现黄芪-当归同一药物成分可对应不同靶点，GO富集显示同一靶点可参与不同生物学过程，可在多条KEGG信号通路中富集，提示黄芪-当归多成分、多靶点、多途径治疗糖尿病足，促进溃疡愈合的作用特点。同时通过调控网络中关键分子、关键途径和关键模块，能定量地代表草药配方的整体调控机制，为进一步研究药对黄芪-当归或复方丹黄消炎液的潜在作用机制提供了新的方向[24-25]。但网络药理学以人工智能算法和大数据为核心，主要调控靶点及通路机制还需进一步动物或细胞实验验证。