一种5,5′,6,6′-四氯-1,1′-3,3′-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物的合成方法

程少冰, 张晓梅

(1. 中国科学院 成都有机化学研究所,四川 成都 610041; 2. 中国科学院大学,北京 100049)

5,5′,6,6′-四氯-1,1′-3,3′-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物也称JC-1,广泛应用于检测线粒体膜电位[1-3]。在线粒体膜电位较高时,JC-1聚集在线粒体的基质中,形成聚合物(J-aggregates)后可以产生红色荧光;在线粒体膜电位较低时,JC-1不能聚集在线粒体的基质中,此时JC-1为单体,可产生绿色荧光[4-8]。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例,因此JC-1具有重要的应用价值。

本文利用易获得的廉价原料1,2,4-三氯-5-硝基苯为起始物,经过乙胺亲核取代、芳硝基氯化亚锡还原、杂环化以及分子骈合最终获得JC-1(Scheme 1)。

Scheme 1

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker-300 MHz型核磁共振仪(CDCl3或DMSO-d6为溶剂,TMS为内标)。

溶剂除特别说明外均为国产市售分析纯试剂。

1.2 合成

(1) 4,5-二氯-N-乙基-2-硝基苯胺(2)的合成

将1,2,4-三氯-5-硝基苯1(88 g, 0.39 mol)溶解在乙胺水溶液(220 mL)中,直接在油浴45 ℃中回流反应2 h(反应0.5 h左右有黄色固体析出)。反应完毕,趁热过滤,滤饼用水洗涤,烘干得化合物2(86.9 g, 95%);1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 8.27(s, 1H), 7.89(brs, 1H), 6.95(s, 1H), 3.27～3.36(m, 2H), 1.35～1.40(m, 3H)。

(2) 4,5-二氯-N1-乙苯-1, 2-二胺(3)的合成

将4, 5-二氯-N-乙基-2-硝基苯胺2(47 g, 0.2 mol)和SnCl2(226 g, 1.0 mol)溶解在乙醇(350 mL)中,回流反应过夜。减压蒸除大部分乙醇,剩余物倒入大烧杯中,加入水(80 mL)和碳酸钠,直至无气泡产生。用二氯甲烷(3×100 mL)萃取,合并有机相,用无水硫酸钠干燥,浓缩,残余物冷冻得深绿色固体3(22.8 g, 56%);1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ: 6.73(s, 1H), 6.68(s, 1H), 3.5～3.52(brs, 1H), 3.05～3.15(m, 2H), 1.22～1.37( m, 3H)。

(3) 5,6-二氯-1-乙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑(5)的合成

向4, 5-二氯-N1-乙苯-1,2-二胺3(20.5 g, 0.1 mol)加入乙醚(100 mL),搅拌下将溶于乙醚(100 mL)的乙酸酐(9.5 mL, 0.1 mol)缓慢滴加到反应液中,滴加过程中产生灰白色固体,反应过夜。停止反应,过滤,母液旋干,固体用二氯甲烷和石油醚重结晶得到灰白色固体。向灰白色固体中加入甲苯(100 mL)以及对甲苯磺酸(1.7 g, 0.01 mol),于110 ℃回流反应过夜。停止反应,冷却至室温,有白色固体析出。过滤,母液旋干得到固体,用二氯甲烷(100 mL)溶剂,并用1 N氢氧化钠溶液(3×50 mL)洗涤,用无水硫酸钠干燥,浓缩,残余物用二氯甲烷和石油醚重结晶得到灰白色固体5(15.5 g, 68%);1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ: 7.74(s, 1H), 7.39(s, 1H), 4.08～4.15(m, 2H), 2.59(m, 3H), 1.38～1.43( m, 3H)。

(4) 5,6-二氯-1,3-二乙基-1-碘-2-甲基-2,3-二氢-1H-苯并[d]咪唑-1-碘化物(6)的合成

将5,6-二氯-1-乙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑5(23 g, 0.1mol)溶解在乙醇(150 mL)中,然后在室温下加入碘乙烷(24 mL, 0.3 mol),于100 ℃回流过夜(TLC检测)。待反应结束,停止加热并冷却至室温,滤出固体,用丙酮(2×30 mL)洗涤,真空干燥得黄白色固体6(30.8 g, 80%);1H NMR(300 MHz, DMSO-d6)δ: 8.55(s, 2H),4.47～4.54(m, 4H), 2.93(s, 3H),1.34～1.39(m, 6H)。

(5) 2,2,2-三氯-1-乙氧基乙烷-1-醇(7)的合成

将水合乙醛(100 g, 0.61 mol)溶解在无水乙醇(62 mL, 1.05 mol)中,于80 ℃回流反应3 h。停止反应,减压蒸除溶剂,残余物冷却,有白色晶体析出,过滤,滤饼真空干燥得化合物7(92.6 g, 80%);1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 4.85(s, 1H), 3.93～4.03(m, 1H), 3.74～3.85(m, 1H), 1.27～1.33( m, 3H)。

(6)JC-1的合成

将钠(11.5 g, 0.5 mol)溶解在无水乙醇(200 mL)中,加入化合物6(38.5 g, 0.1 mol),搅拌5 min;加入化合物7(12 g, 0.06 mol),加毕,将反应体系置于100 ℃下回流反应5 h(TLC检测)。停止加热并冷却至室温,过滤,固体用甲醇重结晶得JC-1(18.8 g, 58%);1H NMR(300 MHz, DMSO-d6)δ: 8.02(s, 4H), 7.78～7.87(m, 1H), 5.98(d,J=12.0 Hz, 2H), 4.32～4.34(m, 8H), 1.34～1.39(m, 12H)。

以廉价易得底物1,2,4-三氯-5-硝基苯为起始底物,经过6步克级反应,以18%的总收率获得了线粒体膜电位的荧光探针JC-1,为相关结构的荧光探针提供了一条便捷、有效的途径。