两亲性双硫键双菁染料的合成及其谷胱甘肽响应荧光性质

王 鹏, 林一凡, 胡利明, 莫善雁

(北京工业大学 环境与生命学部 北京市环境与病毒肿瘤学重点实验室,北京 100124)

菁染料具有优秀的光学性质,如摩尔吸收系数高、吸收和发射波段较长、荧光量子产率较高等[1-3]。目前,已有大量基于菁染料的响应型分子探针被应用于肿瘤组织的诊疗,例如吲哚菁绿(ICG)[4]已被FDA批准用于临床,800CW、ZW800-1等正在进行临床III期研究。

菁染料具有较大的共轭烯烃体系,在水溶液中易造成聚集诱导淬灭现象[5-8],导致荧光成像的信号减弱。然而,该性质对于降低染料(尤其是双菁染料)在普通组织的成像背景有独特的效果。由于双菁染料具有比单菁染料更大的共轭体系,因此荧光淬灭更强。此外,如采用可响应肿瘤微环境断裂的基团连接双菁染料,则可在肿瘤部位释放出具有较强荧光信号的单菁染料,实现荧光恢复,最终实现肿瘤组织的高分辨荧光成像。但目前所报道的双菁染料荧光淬灭还不够完全,在正常组织中仍有部分残留背景。另外,水溶性双菁染料尚未到达肿瘤部位荧光恢复就已被肾脏等组织代谢清除[9-11],体内肿瘤组织成像效果较差。

鉴于此,本文设计合成了一种两亲性双菁染料(Scheme 1),该染料由一个水溶性菁染料与一个脂溶性菁染料通过双硫键连接组成。在单体状态下,双菁染料荧光部分淬灭,但在水中自组装成纳米粒子后,荧光淬灭高达92%;该纳米粒子与谷胱甘肽(GSH)响应后可将双硫键断裂,分解成具有较强荧光的单菁染料,荧光恢复。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UV-3200型紫外可见分光光度计;LS-45/55型荧光分光光度计;Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪;ASCEndTM 400 MHz型核磁共振仪。

碘甲烷,99.5%,萨恩化学试剂(上海)有限公司;对巯基苯甲酸,99%,安耐吉;无水N,N-二甲基甲酰胺,99%,席恩思;O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐,99%,麦克林;N,N-二异丙基乙胺,99%,安耐吉;三氟乙酸,98%,源叶生物;Cl-SO3Cy7,实验室自制;Cl-Cy7.5,实验室自制;胱胺盐酸盐,99%,安耐吉;谷胱甘肽,99%,源叶生物;二碳酸二叔丁酯,99%,席恩思;其余所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

(1) 化合物1的合成

将Cl-Cy7.5(0.5 g, 0.86 mmol)与对巯基苯甲酸(0.264 mg, 1.62 mmol)溶于12 mL无水DMF中,氩气保护下反应15 h。反应结束后加入水(20 mL),用二氯甲烷(3×20 mL)萃取,有机相用无水硫酸钠干燥,浓缩,再经硅胶柱层析纯化得化合物1，绿色固体356 mg,产率59.3%;1H NMR (400 MHz, MSO-d6)δ: 8.67(d,J=14.3 Hz, 2H), 8.22(d,J=8.5 Hz, 2H), 8.06(d,J=12.2 Hz, 8.6 Hz, 4H), 7.90(d,J=8.5 Hz, 2H), 7.75(d,J=12.2 Hz, 2H), 7.65～7.56(m, 2H), 7.52～7.41(m, 4H), 6.37(d,J=14.3 Hz, 2H), 3.77(s, 6H), 2.83(s, 4H), 1.98(s, 2H), 1.79～1.56(m, 12H)。

(2) 化合物2的合成

将胱胺盐酸盐(1 g, 4.44 mmol)溶于在50 mL甲醇中,在冰水浴下加入三乙胺(1.86 mL, 13.33 mmol),搅拌30 min。然后逐滴加入二碳酸二叔丁酯(0.506 mL, 4.44 mmol),继续搅拌1 h,再溶液在真空浓缩。残余物用乙醚洗涤(20 mL×3),乙醚层加入1M的NaOH(20 mL),搅拌20 min,分去有机相，水相再用二氯甲烷(2×20 mL)萃取,将所有有机相合并,再用无水Na2SO4干燥,得到852 mg的化合物2,产率74%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.03(t,J=5.8 Hz, 1H), 3.20(dd,J=13.4 Hz, 2H), 2.77(t,J=5.8 Hz, 2H), 2.72(dd,J=13.4 Hz, 4H), 1.37(s, 9H)。

(3) 化合物3的合成

将1(200 mg, 0.28 mmol)溶于10 mL DMF中,依次加入HBTU(130 mg, 0.336 mmol)、 DIPEA(86.12 mg, 0.616 mmol),在氩气保护下常温反应0.5 h。随后,加入2(86.85 mg)继续反应12 h。反应结束后加入水(20 mL),用二氯甲烷(3×20 mL)萃取,有机相用无水硫酸钠干燥,浓缩,再经硅胶柱层析纯化,得到化合物3，绿色固体130 mg,产率54%;1H NMR(400 MHz ,DMSO-d6,)δ: 8.68(d,J=14.1 Hz, 2H), 8.21(d,J=8.2 Hz, 2H), 8.10～8.00(m, 4H), 7.80(d,J=7.7 Hz, 2H), 7.73(s, 2H), 7.60(d,J=7.7 Hz, 2H), 7.49(t,J=7.2 Hz, 2H), 7.42(d,J=8.2 Hz, 2H), 6.93(s, 1H), 6.36(d,J=14.1 Hz, 2H), 3.76(s, 6H), 3.44(s, 2H), 3.13(d,J=7.2 Hz, 2H), 2.82(s, 4H), 2.69(s, 4H), 1.98(s, 2H), 1.71(s, 12H), 1.30(s,9H), 1.23(s,2H)。

Scheme 1

(4) 化合物4的合成

将Cl-SO3Cy7(200 mg, 0.2 mmol)与对巯基苯甲酸(72 mg, 0.4 mmol)加入到8 mL无水DMF中,在黑暗条件下反应24 h。反应结束后加入水(20 mL),用二氯甲烷(3×20 mL)萃取,有机相用无水硫酸钠干燥,浓缩,再经硅胶柱层析纯化得化合物4，绿色固体120 mg,产率56%;1H NMR(400 MHz ,DMSO-d6)δ: 8.61(d,J=13.3 Hz, 2H), 7.80(d,J=8.3Hz, 2H), 7.67(d,J=13.3 Hz, 2H), 7.60(d,J=8.2 Hz, 2H), 7.35(d,J=8.3 Hz, 2H), 7.19(d,J=8.2 Hz, 2H), 6.37(d,J=14.3 Hz, 2H), 4.20(dd,J=14.7 Hz, 4H), 2.84～2.66(m, 4H), 2.03～1.82(m, 4H), 1.64(d,J=14.3 Hz, 2H), 1.40(d,J=14.7 Hz, 8H), 1.23(s, 12H)。

(5) 化合物SO3Cy7-ss-Cy7.5的合成

常温下,将4(80.14 mg, 0.08 mmol)溶于5 mL DMF中,依次加入HBTU(36.28 mg, 0.096 mmol)、 DIPEA(22.66 mg, 0.176 mmol),反应半小时后,加入3(80 mg, 0.096 mmol),继续反应过夜。反应结束后加入水(20 mL),用二氯甲烷(3×20 mL)萃取,有机相用无水硫酸钠干燥,浓缩,再经硅胶柱层析纯化得化合物SO3Cy7-ss-Cy7.5,绿色固体83 mg,产率51%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6,)δ: 8.73～8.60(m, 4H), 8.48(d,J=13.2 Hz, 2H), 8.20(d,J=8.2 Hz, 2H), 8.06～7.96(m, 4H), 7.86(d,J=8.2 Hz, 2H), 7.72(d,J=8.3 Hz, 4H), 7.67(s, 2H), 7.59(dd,J=13.2 Hz, 7.9 Hz, 4H), 7.49～7.43(m, 2H), 7.40(d,J=8.3 Hz, 2H), 7.34(d,J=8.3 Hz, 2H), 7.28(d,J=8.3Hz, 2H), 6.41～6.30(m, 4H), 4.15(s, 4H), 3.75(s, 6H), 2.79(s, 12H), 1.93(s, 4H), 1.74(s, 8H), 1.70(s, 8H), 1.34(s, 12H), 1.22(s, 12H); MS(MALDI-TOF)m/z: calcd for C88H100N6O14S8Na2{[M+2Na]+}1766.4848, found 1766.4790。

1.3 荧光染料纳米粒子(SO3Cy7-ss-Cy7.5)的光谱性质测试

(1) 纳米粒子的制备

将5 mg上述合成的SO3Cy7-ss-Cy7.5加入到2 mL DMSO中,充分搅拌2 h。将溶液滴加至5 mL去离子水中,继续搅拌1 h。然后将溶液转移到透析袋(MWCO=8000 g·mol-1)中透析48 h,每6 h换一次去离子水[12-13]。

(2) 谷胱甘肽母液的配制

称取10 mg谷胱甘肽,用1000 μL的移液枪稀释至3259 μL,制备得到浓度为10 mM的谷胱甘肽(GSH)母液,避光保存备用。

1.4 荧光染料纳米粒子(SO3Cy7-ss-Cy7.5)不同浓度GSH响应的荧光光谱测试方法

配制若干批纳米粒子待测液(5 μM),分别加入稀释成不同浓度的GSH溶液(1-2500 μM)。静置60 min后转移至荧光专用比色皿中,记录在792 nm激发下的荧光强度值。利用Origin软件绘制浓度-荧光依赖曲线(横轴为GSH浓度,纵轴为对应的荧光响应强度)

1.5 纳米粒子抗干扰能力的测试方法

配制若干批探针纳米粒子待测液(5 μM),分别加入相同浓度的His, Ser, Cys, GSH, Tyr, Glu, Arg等氨基酸,记录在792 nm激发下的荧光强度值。

1.6 纳米粒子稳定性的测试方法

配制两批探针纳米粒子待测液(5 μM),其中一组不添加GSH,然后分别加入不同pH(2～12)的PBS缓冲液;另一组加入GSH(1.5 mM),加入PBS缓冲溶液,调节pH(2～12),记录在792 nm激发下的荧光强度值[14-15]。

1.7 纳米粒子细胞毒性的测试方法

将Hela细胞以每孔5000的密度预先接种于96孔中,培养4 h。然后用不同浓度纳米粒子的孵育24 h。用MTS法检测评估细胞存活率。

2 结果与讨论

2.1 表征

图1为纳米粒子的DLS图。由图1可知,纳米粒子的平均尺寸约为52.6 nm。

Diameter/nm 图1 纳米粒子(20 μM/L)的DLS图

2.2 纳米粒子的识别机理

GSH与纳米粒子中双染料二硫键发生反应,二硫键断裂,生成具有较强荧光的单菁染料,进而发出荧光信号(Scheme 2)。

Scheme 2

2.3 光谱性质

双染料纳米粒子(水溶液),双染料单体(DMSO溶液)和Cl-SO3Cy7(水溶液)的紫外可见光吸收谱图(a)和荧光谱图(b)如图2所示。紫外光谱(a)显示,双染料单体和Cl-SO3Cy7的最大吸收波长均在775 nm附近,而在纳米粒子的谱图中,出现了较为明显的肩峰(700 nm),表明纳米粒子内部存在较严重的聚集作用。荧光光谱(b)进一步验证了该聚集现象,据统计,纳米粒子的荧光强度仅为Cl-SO3Cy7的8%。以上结果说明,双染料纳米粒子的高荧光淬灭特性可以降低染料在正常组织的成像背景。

λ/nm

2.4 纳米粒子与GSH反应之后的荧光谱图变化

将纳米粒子的PBS溶液(5 μM, pH=7.4)与GSH(1.5 mM)处理后,833 nm处的荧光信号强度逐渐增强。75 min后,达到最大强度,此时的强度为加入GSH前的16倍(图3)。

c/μM图3 纳米粒子(5 μM)与GSH(1.5 mM)反应过程的时间-荧光强度依赖曲线

2.5 纳米粒子与不同浓度GSH反应后的荧光强度变化

在两亲性双染料纳米粒子(5 μM, PBS, pH=7.4)中加入不同浓度GSH溶液(0～2500 μM/L)时,纳米粒子的荧光恢复率与GSH的浓度密切相关。如图4所示,随着GSH浓度增加,荧光强度变大的幅度也增加,当GSH的浓度为2.5 mM时,荧光强度达到最大值。

c/μM图4 纳米粒子(5 μM)与GSH(0～2500 μM)反应(75 min)后的浓度-荧光强度曲线

2.6 荧光响应的抗干扰能力

将半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(Glu)、酪氨酸(Tyr)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser)等不同的氨基酸加入到两亲性双硫键双染料纳米粒子溶液中,如图5所示,当氨基酸含巯基(Cys、GSH)时,纳米粒子的荧光恢复程度较大,而当氨基酸中无巯基时,荧光几乎没有恢复。其中,GSH导致的荧光恢复强度远远大于其它氨基酸。这说明双菁染料的纳米粒子GSH响应选择性较高,较适合在生理环境下用该纳米粒子对GSH成像。

Amino acids图5 纳米粒子的抗干扰试验

2.7 pH对荧光响应的影响

为了验证两亲性双硫键双染料纳米粒子是否能适用于人体正常的生理环境,进行pH对荧光响应稳定性的实验,结果见图6。由图6可知,在不添加GSH时,在pH 2～10内,荧光强度都比较弱,几乎没有太大变化,这说明纳米粒子有良好的酸碱稳定性。在添加GSH之后,荧光强度相对于未添加GSH时都有所增强,其中,在pH 6～9内,荧光强度增加较多,因此,该纳米粒子适合在人体的生理内环境进行GSH响应的荧光成像。

pH图6 纳米粒子荧光强度随溶液pH值的变化

2.8 纳米粒子的细胞毒性

通过MTS法评估纳米粒子的体外细胞毒性,用不同浓度的纳米粒子处理Hela细胞,结果见图7。由图7可知,纳米粒子浓度的增加仅导致细胞活力的轻微下降,这表明纳米粒子对细胞几乎没毒性,可以进一步应用于活细胞成像和动物实验。

c/μM图7 细胞存活率

成功合成了一种含双硫键双菁染料,该双染料由于两亲性的的特性,可自组装成纳米粒子,纳米粒子的荧光强度相对于单菁染料淬灭高达92%,而在与GSH响应之后,荧光恢复,荧光强度增大16倍。氨基酸对荧光响应的实验结果表明,该响应对GSH的选择性较高。此外,纳米粒子能在生理环境的pH范围内荧光恢复,且纳米粒子几乎没有细胞毒性。因此,可以进一步应用于GSH的活细胞和动物成像。