新型3-O-乙酰-11-酮基-β-乳香酸衍生物的合成及其体外抗肿瘤活性

刘茂宇, 杨艺辉, 王金华*, 师健友

(1. 成都中医药大学 药学院,四川 成都 611100； 2. 中国医学科学院 药物研究所,北京 100050; 3. 四川省医学科学院·四川省人民医院 药学部,四川 成都 610072)

癌症这类非传染性、慢性疾病现已是造成人类死亡的主要原因之一。癌症的产生是一个多因子、多步骤的复杂过程,具有细胞分化、增殖异常、生长失控和转移性等生物学特征。据世界卫生组织统计,在2018年间约有960万人死亡,约占全球死亡人数的六分之一。人们对于抗肿瘤药的需求逐年上涨,市场上的抗肿瘤新药也不断出现,目前最为常见的抗癌药物有化疗药物、中药、生物制药、靶向药物等,寻求一种治疗效果好,毒副作用低的药物尤为重要[1]。

天然产物因其作为多靶点,多层次,多方位调节的毒性较小的药物从众多靶点单一,毒副作用强的传统药物中脱颖而出[2]。我国已对几千种植物药进行过活性筛选,发现多种植物药中的活性成分具有良好抗癌效果,如喜树碱[3]、紫杉醇[4]、苦参碱[5]、乳香酸[6]等。乳香是一种橄榄科植物卡氏乳香树BoswelliacarterliBirdw.及同属数种植物BoswelliabhaurdajianaBirdw.皮部渗出的油胶树脂,乳香中的主要成分为树脂、树胶和挥发油,其中树脂含量最多(60%～70%),树脂主要成分为游离α,β-乳香脂酸、结合乳香脂酸、蒎烯、二戊烯、α,3-水芹烯等成分,其中最主要的有效成分为五环三萜类化合物,主要可分为齐墩果烷型、乌苏烷型和羽扇豆烷型,另外,树脂中还含有部分四环三萜类化合物[7]。乳香酸(boswellic acid)是乳香中的主要活性成分,属五环三萜类化合物,研究表明,乳香中的三萜具有细胞毒性和抗肿瘤特性[8]。

3-O-乙酰-11-酮基-β-乳香酸(AKBA)是一种具有独特结构的三萜酸,是乳香酸中活性最强的化合物之一,能抑制关键炎症介质5-脂氧合酶(5-LOX)发挥抗炎抗氧化作用,并且能通过抑制VEGFR2和mTOR信号通路有效抑制血管生成和肿瘤生长[9-11]。AKBA具有几个关键的生物活性功能单元,包括C-3位的乙酰氧基、C-24位的羧基和C-11位的酮基,许多新的AKBA衍生物正是从这些药效团出发进行进一步的设计和合成的[12-14]。与天然存在的AKBA相比,在C-3上用酰胺基取代酸和氮的boswellic acid类似物具有更高的选择性抑制5-LOX和增加细胞毒性的潜力[10]。Phillip Krüger团队研究了AKBA的渗透性,在研究限制乳香酸生物利用度的因素实验中发现即使AKBA是一个亲油的化合物,其渗透性却很差,导致其生物利用度低[15],这可能正是AKBA细胞毒性低的主要原因。研究表明,C-24位酰胺基的存在有望提高细胞毒性[10,14,16-17]。

因此我们计划在C-24位引入一系列氨基化合物以合成AKBA酰胺类衍生物,期望得到具有更高细胞毒性的AKBA衍生物。以AKBA为原料,在氯化亚砜既作溶剂,又作反应物的条件下,得到氯取代的AKBA中间体,然后加入氨基化合物进行取代反应,最后得到高产率的AKBA酰胺类衍生物S137、S151、S179、S184、S443、S634、S677、S673(Scheme 1),总收率为88%～96%,其结构经1H NMR和MS(ESI)表征。并采用了CCK8法测试了这8个化合物对人原髓细胞白血病细胞(HL-60)、人结肠癌细胞(HCT116)、人肺癌细胞(A549)的体外抗肿瘤活性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker AMX 400 MHz型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂,TMS为内标)；Agilent 1260 Infinity II型高效液相色谱仪；Q-TOF Premier高分辨质谱仪；Thermo CO2培养箱；Kylin-Bell Lab instruments微型超声振荡器；MD M5型酶标仪。

AKBA,北京药物研究所王金华老师提供；环戊胺、N-异丙基乙二胺、4-氨基四氢吡喃、2-氨甲基吡啶、2-(2-氨乙基)吡啶、(1-甲基-4-哌啶)甲胺、N-(2-氨基乙基)吗啉、炔丙胺,Adamas试剂公司；氯化亚砜,安耐吉化学；CCK-8,碧云天生技术公司；其余所用试剂均为分析纯,科隆化学品有限公司；96孔细胞培养板,Corning。

1.2 AKBA酰胺类衍生物的合成(以S151为例)

将AKBA(20 mg, 1 eq.)溶于过量氯化亚砜中(0.5 mL>1 eq.),在30 ℃下搅拌1 h,点板监测至反应完毕。由于酰氯不稳定,点板时需将酰氯转换成甲酯,吸取30 μL甲醇于2 mL离心管中,再吸取10 μL反应液缓慢滴加于甲醇中(反应放热),最后加入1 mL水,用少量乙酸乙酯进行萃取,取上层点板。反应完毕后将反应瓶直接进行旋蒸,由于氯化亚砜沸点较高,不容易除尽,在旋蒸时可少量多次加入沸点低的二氯甲烷溶液,以更好的除去氯化亚砜。最后得到透明贴壁的固体,烘干后得到白色的氯代AKBA中间体粉末19.68 mg,收率95%。

Scheme 1

将旋蒸得到的中间体(19.68 mg,1 eq.)溶于适量1 mL二氯甲烷溶液中,加入N-异丙基乙二胺(6 mg,1.5 eq.),在30 ℃下进行搅拌反应1 h,点板监测反应至完成。反应完毕后,向反应液中加入8倍量的水,用少量乙酸乙酯进行多次萃取,萃取完后用饱和食盐水洗乙酸乙酯层,再用无水硫酸钠对乙酸乙酯层进行除水操作。最后将有机层旋干,薄层色谱(二氯甲烷/甲醇=30/1,V/V)纯化得白色粉末状固体32.12 mg,收率92%,即为化合物S151。

用类似的方法合成化合物S137、S179、S184、S443、S634、S667和S673。

S137： 深黄色固体,收率62%,含量66.20%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 6.76(d,J=7.1 Hz, 1H), 5.43(s, 1H), 5.11(s, 1H), 3.49～3.41(m, 1H), 2.33(s, 1H), 2.27(d,J=14.2 Hz, 1H), 2.11～2.05(m, 1H), 2.02(s, 3H), 1.86(s, 2H), 1.83(s, 2H), 1.71(d,J=18.9 Hz, 4H), 1.67(s, 1H), 1.63(s, 3H), 1.56(s, 1H), 1.54(s, 2H), 1.51(t,J=3.1 Hz, 2H), 1.48(s, 1H), 1.30(s, 6H), 1.23(s, 2H), 1.21(s, 1H), 1.18(s, 1H), 1.14(s, 1H), 1.09(s, 3H), 1.05(s, 3H), 0.99(s, 3H), 0.92(s, 3H), 0.79(s, 3H), 0.75(d,J=6.2 Hz, 3H); HR-MS(ESI-TOF)m/z: calcd for C37H57NO4Na{[M+Na]+}602.4288, found 602.4177。

S151： 白色固体,收率92%,含量58.65%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.09(t,J=5.7 Hz, 1H), 5.43(s, 1H), 5.11(d,J=2.8 Hz, 1H), 3.24(d,J=7.0 Hz, 2H), 3.02(dd,J= 12.8 Hz, 6.1 Hz, 1H), 2.69(p,J=6.1 Hz, 1H), 2.57(t,J=6.2 Hz, 2H), 2.30～2.22(m, 1H), 2.09(td,J=13.5 Hz, 4.6 Hz, 1H), 2.02(s, 3H), 1.87～1.75(m, 2H), 1.68(d,J=9.5 Hz, 2H), 1.55(d,J=11.0 Hz, 1H), 1.49～1.36(m, 6H), 1.30(s, 5H), 1.26(d,J=8.0 Hz, 1H), 1.22(d,J=4.4 Hz, 2H), 1.18(d,J=4.1 Hz, 1H), 1.14(d,J=6.2 Hz, 1H), 1.11(d,J=5.5 Hz, 3H), 1.04(s, 3H), 1.00(s, 3H), 0.96(d,J=2.9 Hz, 3H), 0.95(d,J=2.9 Hz, 3H), 0.92(s, 3H), 0.79(s, 3H), 0.75(d,J=6.2 Hz, 3H); HR-MS(ESI-TOF)m/z: calcd for C37H61N2O4{[M+H]+}597.4553, found 597.4623。

S179： 白色固体,收率96%,含量78.55%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 6.87(d,J=7.8 Hz, 1H), 5.43(s, 1H), 5.11(s, 1H), 3.82(d,J=11.0 Hz, 4H), 3.25(s, 1H), 2.37(s, 2H), 2.33(s, 1H), 2.28(d,J=14.6 Hz, 1H), 2.09(q,J=15.8 Hz, 13.1 Hz, 2H), 2.03(s, 3H), 1.98(s, 1H), 1.84(d,J=12.7 Hz, 2H), 1.65(d,J=12.6 Hz, 2H), 1.53(s, 1H), 1.41(d,J=13.2 Hz, 6H), 1.30(s, 5H), 1.24(d,J=9.3 Hz, 3H), 1.18(s, 1H), 1.12(d,J=6.5 Hz, 1H), 1.09(s, 3H), 1.05(s, 3H), 1.00(s, 3H), 0.92(s, 3H), 0.79(s, 3H), 0.75(d,J=6.3 Hz, 3H); HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C37H57NO5Na{[M+Na]+}618.4237, found 618.4185。

S184： 白色固体,收率93%,含量70.54%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.47(d,J=4.7 Hz, 1H), 7.82(s, 1H), 7.73(t,J=6.8 Hz, 1H), 7.24(dd,J=15.1 Hz, 7.6 Hz, 2H), 5.42(s, 1H), 5.14(s, 1H), 4.43(dd,J=15.6 Hz, 5.7 Hz, 1H), 4.30(dd,J=15.8 Hz, 5.3 Hz, 1H), 2.36(s, 1H), 2.29(d,J=15.7 Hz, 1H), 2.14～2.05(m, 1H), 2.03(s, 3H), 1.82(s, 2H), 1.75(d,J=12.4 Hz, 1H), 1.68(d,J=13.4 Hz, 1H), 1.54(d,J=10.9 Hz, 1H), 1.43(t,J=14.1 Hz, 6H), 1.30(s, 5H), 1.23(s, 5H), 1.13(s, 3H), 1.07(s, 3H), 0.92(s, 3H), 0.83(s, 3H), 0.79(s, 3H), 0.75(d,J=6.2 Hz, 3H); HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C38H54N2O4Na{[M+Na]+}625.4084, found 625.3973。

S443： 白色固体,收率88%,含量76.44%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.48(d,J=5.0 Hz, 1H), 7.69(t,J=7.6 Hz, 1H), 7.26(d,J=7.7 Hz, 1H), 7.20(t,J=6.0 Hz, 2H), 5.42(s, 1H), 5.10(s, 1H), 2.91(t,J=6.8 Hz, 4H), 2.67(s, 1H), 2.29(s, 1H), 2.09(s, 1H), 2.02(s, 3H), 1.54(d,J=11.4 Hz, 2H), 1.46(d,J=9.6 Hz, 3H), 1.40(s, 2H), 1.38～1.31(m, 4H), 1.29(s, 5H), 1.24(s, 5H), 1.02(s, 3H), 0.98(s, 3H), 0.92(s, 3H), 0.83(s, 3H), 0.79(s, 3H), 0.75(d,J=6.3 Hz, 3H); HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C39H56N2O4Na{[M+Na]+}639.4240, found 639.4133。

S634： 白色固体,收率93%,含量65.16%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.21(s, 1H), 5.44(s, 1H), 5.11(s, 1H), 3.03～2.95(m, 1H), 2.89～2.80(m, 1H), 2.71(d,J=10.9 Hz, 2H), 2.37(s, 1H), 2.26(d,J=14.2 Hz, 1H), 2.10(s, 3H), 2.03(s, 3H), 1.80(d,J=13.8 Hz, 2H), 1.73(d,J=11.0 Hz, 2H), 1.61(d,J=15.7 Hz, 2H), 1.55(d,J=11.2 Hz, 3H), 1.49～1.36(m, 6H), 1.30(s, 5H), 1.25(d,J=9.7 Hz, 3H), 1.19(s, 1H), 1.14(s, 1H), 1.11(s, 1H), 1.08(s, 3H), 1.04(s, 3H), 0.99～0.96(m, 3H), 0.92(s, 3H), 0.79(s, 3H), 0.75(d,J=6.2 Hz, 3H); HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C39H63N2O4{[M+H]+}623.4710, found 623.4858。

S667： 黄色固体,收率85%,含量54.09%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.60(s, 1H), 6.96(s, 1H), 5.44(s, 1H), 5.12(d,J=3.0 Hz, 1H), 3.59(t,J=4.7 Hz, 2H), 3.55(t,J=4.7 Hz, 4H), 2.91(t,J=6.2 Hz, 1H), 2.46(d,J=6.1 Hz, 1H), 2.39(d,J=6.8 Hz, 5H), 2.33(s, 1H), 2.15～2.05(m, 1H), 2.03(s, 3H), 1.83(dd,J=15.7 Hz, 11.2 Hz, 2H), 1.75(d,J=14.8 Hz, 1H), 1.72～1.67(m, 1H), 1.55(d,J=10.9 Hz, 1H), 1.43(d,J=10.2 Hz, 6H), 1.31(s, 5H), 1.23(s, 2H), 1.19(s, 1H), 1.13(s, 3H), 1.04(s, 3H), 1.02(s, 3H), 0.92(s, 3H), 0.80(s, 3H), 0.76(d,J=6.2 Hz, 3H); HR-MS(ESI-TOF) m/z: calcd for C38H60N2O5Na{[M+Na]+}647.4502, found 647.4395。

S673： 白色固体,收率94%,含量83.74%;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 7.57(t,J=5.6 Hz, 1H), 5.39(s, 1H), 5.06(d,J=2.8 Hz, 1H), 3.89(ddd,J=17.1 Hz, 5.9 Hz, 2.5 Hz, 2H), 3.68(ddd,J=17.1 Hz, 5.3 Hz, 2.5 Hz, 2H), 2.59(s, 1H), 2.55(s, 1H), 2.23(d,J=14.3 Hz, 1H), 2.05(td,J=13.5 Hz, 4.8 Hz, 1H), 1.99(s, 3H), 1.80(dd,J=13.7 Hz, 5.0 Hz, 1H), 1.73(d,J=12.7 Hz, 1H), 1.64(d,J=13.0 Hz, 1H), 1.60(d,J=9.0 Hz, 1H), 1.51(d,J=11.1 Hz, 1H), 1.44～1.33(m, 6H), 1.26(d,J=4.0 Hz, 5H), 1.22(d,J=7.8 Hz, 1H), 1.19(d,J=5.3 Hz, 1H), 1.18～1.16(m, 1H), 1.16～1.13(m, 1H), 1.12～1.07(m, 1H), 1.05(s, 3H), 0.99(s, 3H), 0.94(s, 3H), 0.88(s, 3H), 0.75(s, 3H), 0.71(d,J=6.4 Hz, 3H); HR-MS(ESI-TOF) m/z: calcd for C35H52NO4{[M+H]+}550.3818, found 550.3900。

1.3 抗癌活性测试

采用CCK8法测试化合物S137、S151、S179、S184、S443、S634、S667、S673和AKBA对人原髓细胞白血病细胞(HL-60)、人结肠癌细胞(HCT116)、非小细胞肺癌细胞(A549)的细胞增殖抑制作用。取对数生长期的细胞,HL-60和HCT116选择1640培养基,A549选择DMEM培养基,将细胞进行复苏、传代等操作后,待细胞长到良好的形态时,将细胞用胰酶消化下来,进行离心,混合均匀,计数,以每孔3000个细胞/100 μL接种于96孔板中,置于5%CO2、 37 ℃培养箱中培养24 h。 24 h后,加入不同浓度梯度(终浓度为30 μM、 10 μM、 3 μM、 1 μM、 0.3 μM、 0.1 μM)的S151、S179、S184、S443、S634和AKBA各100 μL,含HCT116细胞和A549细胞的孔板，含孵育72 h后弃去培养基,每孔加入含有无血清培养基稀释的 CCK8溶液(1/10稀释)100 μL,含HL-60细胞的孔板孵育72 h后，每孔加入CCK8溶液20 mL，于37 ℃孵育0.5～2 h,孵育后可观测到孔板内培养基变为不同深度的橙色,用酶标仪在450 nm处检测吸光度值。根据相对细胞增殖抑制率和药物浓度,由软件GraphPad Prism计算得出半效抑制浓度(IC50)。

2 结果与讨论

2.1 抗癌活性

表1为化合物的体外抗肿瘤活性。由表1可知,这8个AKBA酰胺类衍生物中S137、S151、S179、S634、S677、S673的抗癌活性都有不同程度的增加,尤其是化合物S137、S151和S634,其中S137对HL-60和A549的抑制效果较好,IC50分别为1.781和1.763 μM,优于AKBA(IC50=16.160 μM和10.900 μM),S151对HL-60抑制效果最好,IC50为1.255 μM,优于AKBA(IC50=16.160 μM),S634对HCT116的抑制效果最好,IC50为1.193 μM,优于AKBA(IC50=13.020 μM)。有研究表明酰胺基取代酸的boswellic acid衍生物具有更高的细胞毒性,且在癌症治疗中发挥凋亡作用[18],我们的实验结果印证了对AKBA进行酰胺取代后,细胞毒性有所增强。

表1 化合物的体外抗肿瘤活性

2.2 构效关系

被动扩散是大多数药物的主要扩散机制,AKBA酰胺类衍生物进入到癌细胞内来发挥抑癌作用,需要通过细胞膜这个屏障。细胞膜主要是由磷脂双分子层的基本骨架构成的,外层是亲水的极性头部集团,内层是疏水性脂肪链,药物通过被动扩散的方式通过细胞膜时,药物分子周围的水和分子首先脱落,氢键断裂,然后药物通过磷脂分子的极性头部集团,再通过脂肪连亲脂区域,脂溶性较强的化合物更容易通过磷脂双分子层膜的内部区域[19]。AKBA通过结构改造成酰胺类化合物后脂溶性增强,从结果可以看出,化合物的脂溶性增强,细胞毒性也不同程度的加强。

通过比较S184、S634和其他衍生物,可看出AKBA酰胺衍生物中取代基为脂肪胺的化合物活性优于取代基为芳胺的化合物。通过比较S184、S634、S667和其他衍生物,可看出AKBA酰胺衍生物中取代基为饱和胺的化合物活性优于不饱和胺的化合物。再通过比较S137、S151、S179、S634和S667,可看出AKBA酰胺衍生物中氨基取代基不含氧的化合物活性优于氨基取代基中含氧的化合物,且氨基取代基中含有多余氮的化合物活性优于氨基取代基中未含有多余氮的化合物。

合成了8个AKBA酰胺类衍生物,通过抗肿瘤细胞增殖测试最终得到活性较好的化合物S137,S151和S634。其中S137对HL-60和A549的抑制效果较好(IC50分别为1.781和1.763 μM),其活性是分别是AKBA(IC50=16.160和10.900 μM)的9.07倍和6.18倍,S151抑制HL-60效果最好(IC50=1.255 μM),其活性是AKBA(IC50=16.160 μM)的12.88倍,S634抑制HCT116效果最好(IC50=1.193 μM),其活性是AKBA(IC50=13.020 μM)的10.91倍,结果显示对于AKBA的结构优化是有用的,且取代基为含氮脂肪胺的AKBA衍生物活性最好,能够显著提高化合物的细胞毒性。