辐照灭菌对芪及散主要成分的影响

王文习，杨 静，周 娜，王 宁，未金焕，李云霞

芪及散为解放军联勤保障部队第九八〇医院研发的非标准制剂，主要由黄芪、党参、茯苓、当归、木香、黄芩、甘草等十味药组成，具有健胃止痛的功效，用于十二指肠球部溃疡、胃溃疡、十二指肠球炎[1]。该制剂为中药饮片混合粉碎制成的散剂，在生产过程中，考虑到温度对制剂成分的影响，常规的干热灭菌法不能达到制剂的微生物限度要求，需要用到60Co-γ射线灭菌。近几十年来，60Co-γ射线灭菌已在全世界广泛进行，由于高穿透性、方便性、快速性、便宜的节能效益和理想的灭菌效果[2-3]，在中医药领域，60Co-γ射线灭菌的方法也得到广泛利用，特别是在中国传统药物中，易挥发、热敏感的中药材及蜜丸的灭菌，使用尤其广泛[4]。中药的复杂化学成分在辐射期间可能受到影响，药品的质量也有可能无法保证。CFDA 2015年颁布的《中药辐照灭菌技术指导原则》建议对原料药和最终产品尽可能采用低剂量辐照灭菌，中药最大总体平均辐照剂量原则上不超过10 kGy，在本研究中对芪及散的2次辐照剂量均为8 kGy。随着全球对中药的需求稳步增加，中药质量标准尤为重要。中药指纹图谱是建立中药材及其制剂质量标准行之有效的方法，可以用来测定其中某些成分的含量，也可以控制很多其他不便进行含量测定的成分[5-6]。在本研究中，我们在辐照前和辐照后建立了芪及散的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱，同时测定了辐照前和辐照后黄芩苷和汉黄芩苷的含量变化，研究了芪及散的辐照灭菌效应，探讨应用60Co-γ射线灭菌对制剂质量的影响[7-9]。

1 仪器与试药

1.1试验仪器 安捷伦1100 HPLC仪(G1322型在线脱气机、G1311A型二元泵、G1313A型自动进样器、G1315B二极管阵列检测器、A.08化学工作站，美国Agilent公司)，BT214D、BT125D型分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)，雷磁PHS-3C型酸度计(上海仪电科学仪器股份有限公司)，KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试验药品 乙腈为色谱纯(天津市康科德科技有限公司)；磷酸为色谱纯(Fisher Scientifico-phosphoric acid，85%)；乙醇为分析纯；水为超纯水。黄芩苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110715-201619，纯度93.5%)；汉黄芩苷对照品(成都曼思特生物科技有限公司中国科学院成都生物研究所，批号：MUST-18111601，纯度99.06%)；芪及散(批号：20190402，辐照2次，辐照剂量每次8 kGy)。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温25 ℃；流速1 ml/min；检测波长280 nm；以0.1%磷酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱[10-20]，梯度程序为0～5 min，10% B；5～13 min，10%～15% B；13～20 min，15%～20% B；20～45 min，20%～45% B；45～55 min，45%～50% B；55～60 min，50%～10% B；信号采集时间为80 min，进样量为10 μl。

2.2溶液制备

2.2.1对照品储备液的制备：精密称取黄芩苷和汉黄芩苷对照品适量，分别置于25 ml量瓶，加入适量70%乙醇振摇，超声使溶解，放至室温，用70%乙醇稀释至刻度，摇匀，制得单一成分对照品储备液，黄芩苷的浓度为1.098 mg/ml，汉黄芩苷的浓度为0.6090 mg/ml。

2.2.2对照品溶液的制备：用移液管精密量取2种对照品储备液各1 ml，置10 ml容量瓶中，再用70%乙醇稀释至刻度，振摇均匀，得到黄芩苷和汉黄芩苷的混合对照品溶液。

2.2.3供试品溶液的制备：精密称量供试品约0.5 g，放入50 ml量瓶中，加入70%乙醇约40 ml，浸润30 min后，超声3次，每次3 min，超声间隔10 min，放置室温，加入70%乙醇混合稀释至刻度，摇匀，定量滤纸过滤，收集滤液；精密量取2 ml放入10 ml量瓶中，再用70%乙醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，得到供试品溶液。

2.2.4阴性样品溶液的制备：按处方量制备没有黄芩药材的阴性样品，阴性样品按照“2.2.3”项下供试品溶液制备方法操作，得到不含黄芩的阴性样品溶液。

2.3方法学考察

2.3.1专属性试验：取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液分别进样，记录色谱图，结果显示，阴性样品溶液不干扰指纹图谱的测定。见图1。

图1 芪及散中黄芩苷和汉黄芩苷专属性试验高效液相色谱图

2.3.2线性与范围：取各对照品储备液逐级稀释成系列浓度的混合对照品溶液，进行分析，记录2种对照品的色谱峰面积，以各指标成分的浓度(X，μg/ml)为横坐标，以色谱峰面积A为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，黄芩苷浓度范围2.47～65.88 μg/ml,线性方程Y=38.827X+2.0885,R2=1;汉黄芩苷浓度范围0.9135～24.36 μg/ml,线性方程Y=40.572X+2.4811,R2=1。结果表明3个指标成分在所测定的浓度范围内线性关系较好。

2.3.3精密度试验：取“2.2.2”项下的混合对照品溶液(成分的浓度分别是：黄芩苷21.96 μg/ml和汉黄芩苷6.09 μg/ml)，连续进样6次，记录2个成分的峰面积。黄芩苷、汉黄芩苷峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.5%、0.5%。结果表明，系统的精密度良好。

2.3.4重复性试验：平行制备6份样品溶液，进样分析并记录色谱图。记录样品中黄芩苷和汉黄芩苷对应的峰面积，计算其含量，根据6次测定结果的RSD来研究该方法的重复性。2个指标成分黄芩苷和汉黄芩苷的RSD分别为2.5%和2.7%。结果表明，该方法具有良好的重复性。

2.3.5加样回收率试验：用电子分析天平精密称定芪及散(辐照前)约0.25 g，称量6份，分别置于50 ml量瓶中，每个量瓶中分别加入黄芩苷储备液2 ml、汉黄芩苷储备液0.7 ml，再加入适量70%乙醇，按“2.2.3”项中方法配制供试品溶液，分别加入进样器测定，进行分析，记录色谱图。根据公式：回收率=(测得量-本底量)/加入量×100%计算黄芩苷和汉黄芩苷的回收率。结果表明，方法准确度良好。见表1。

表1 芪及散中黄芩苷和汉黄芩苷加样回收率实验结果(n=6)

2.3.6稳定性试验：取“2.2.3”项下的供试品溶液，于24 h内每4小时分析1次，记录色谱图。记录2个成分峰面积，计算黄芩苷和汉黄芩苷的RSD值分别为1.4%、1.3%。结果表明，溶液在24 h内的稳定性良好。

2.4供试品含量测定 精密称取辐照前和辐照后的芪及散，按“2.2.3”项下方法操作，计算黄芩苷和汉黄芩苷的含量，其中黄芩苷辐照前为8.45 mg/g，一次辐照后为8.73 mg/g，二次辐照后为8.59 mg/g；汉黄芩苷辐照前为1.71 mg/g，一次辐照后为1.77 mg/g，二次辐照后为1.75 mg/g。结果显示，辐照前后供试品的2个指标成分含量没有明显变化。

2.5相似度分析

2.5.1对照指纹图谱的建立：精密称取芪及散(辐照前)0.5 g，制备供试品溶液，进样分析，记录色谱图，得到对照色谱图。

2.5.2指纹图谱的分析：2次辐照后的芪及散分别平行制备8份供试品溶液，注入进样器分析，记录色谱图，测定供试品的指纹图谱。

2.5.3相似度分析：以辐照前芪及散的色谱图为参照图谱，将2次辐照得到的色谱图与辐照前的色谱图比较。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》研究版(2004A)分析检验，计算相似度，供试品2次辐照前后色谱图相似度均≥0.999，相似度结果显示辐照前后供试品的含量并无明显差异。结果见图2、图3。

图2 芪及散第1次辐照后对照指纹图谱与供试品指纹图谱

图3 芪及散第2次辐照后对照指纹图谱与供试品指纹图谱

3 讨论

本研究应用HPLC测定，通过相似度分析，可以快速准确地识别黄芩苷和汉黄芩苷，用于建立芪及散的指纹图谱，提供了芪及散的整体信息，进行了辐照前后成分种类和含量的详细比较。芪及散的色谱指纹图谱有7个共有峰，结果表明，辐照前后两种指标成分黄芩苷和汉黄芩苷的含量几乎没有显著差异，提取的芪及散成分的种类和含量也基本没有变化，可以认为实验中的辐照剂量对芪及散质量没有影响，实际生产中可以采取辐照的方法，按照指导剂量进行辐照灭菌。

为了减少温度对测定结果的影响，实验采用柱温25 ℃进行。实验过程中对检测波长进行考察，分别在210、225、267、280、316 nm共5个波长处进行研究比较，发现在280 nm波长处测得的色谱峰较多，分离效果最好，且黄芩苷和汉黄芩苷在此波长处有强紫外吸收，故检查波长选择280 nm。

实验条件是梯度洗脱，以0.1%磷酸溶液作为流动相A和乙腈流动相B，在洗脱过程中两种极性不同的溶剂以不同比例混合连续或者间歇的改变，流动相极性改变，可以改善样品中不同组分的分离度，可以更好地分析待测成分。实验过程中多次调节梯度洗脱的时间及两种溶剂的比例，最终选出本实验所用的条件，在此条件下，分离度更好。

实验过程中还对提取溶剂进行考察，分别采用水、70%乙醇、无水乙醇和甲醇进行提取，之后进行色谱图分析，用水和无水乙醇提取得到的色谱图基线漂移，峰分离效果不好，采用70%乙醇和甲醇提取所得色谱图基本重合，但是乙醇相对更安全、环保，所以采用70%乙醇提取供试品。