贯叶金丝桃提取物对高原肺水肿大鼠的保护作用

王谨涵，任晓霞，李晓琳，马君义，陈丽萍，李茂星，邱建国

当人类从平原快速进入高海拔环境时，高原低氧、低压、高辐射等特殊环境因素引起机体动脉血氧分压和血氧饱和度降低，导致器官和组织缺氧，血管渗透性发生紊乱，致肺血管收缩和高血压，驱动肺泡液体积聚，引发高原肺水肿(high altitude pulmonary edema，HAPE)[1-5]。HAPE是一种高风险病理生理改变，如果不及时诊断和治疗，可能致命[6]。研究表明，在高原相关疾病中，缺氧和炎症危害巨大[7-8]，二者往往同时发生，相互依存。一方面，缺氧引起的过氧化应激将导致炎症反应的发生，影响器官功能，并伴随一系列疾病的出现。另一方面，炎症性疾病导致供氧不平衡进而使组织缺氧[9]。

目前，乙酰唑胺、红景天等抗高原反应药物具有很大的局限性。因此，高原特殊环境损伤防治药物亟待开发。贯叶金丝桃因具有抗抑郁、抗菌作用而被广泛应用于大众医学和植物疗法中，同时也具有显著的抗炎、抗缺氧等药理活性[10]。金丝桃苷(HYP)和金丝桃素常作为其质量评价指标[11]。本研究采用大型低压氧舱模拟海拔7500 m的高原环境，通过对大鼠肺组织病理切片的观察及肺组织含水量、氧化应激指标、炎性因子的测定，研究贯叶金丝桃提取物(HPE)对HAPE大鼠的保护作用，以期为相关疾病的治疗提供参考和实验依据。

1 材料与方法

1.1药物与试剂 贯叶金丝桃采自甘肃省康县福祥中药材种植农民专业合作社，经鉴定为贯叶金丝桃的干燥地上部分。贯叶金丝桃干燥地上部分粉碎后加8～10倍量70%乙醇于65 ℃回流提取3次，每次1 h，静置，抽滤，合并3次滤液，减压浓缩得浓度为49.11 g/L的上样液。母液按样品与树脂的质量比为1∶15(g/g)缓慢、匀速地注入预先处理好的D101型大孔吸附树脂柱(9.55 cm×85 cm)中，并以2.4 ml/min流速吸附26 h。然后分别用20%、95%乙醇以2.0 BV/h的流速洗脱至流出液为无色，收集95%乙醇洗脱液，40 ℃旋转蒸发，浓缩液冷冻干燥后加入75倍量的乙酸乙酯，磁力搅拌下50 ℃加热回流提取3次，每次1 h，静置，抽滤，收集滤液，浓缩并冷冻干燥。将干燥后的药粉再加入14倍量的乙酸乙酯，低温静置，滤纸过滤，滤饼干燥后得HPE，参照文献[12]测得HYP含量为47.01%，金丝桃素含量为1.70%。整个提取分离过程避光操作。

HYP(纯度>98%，江苏永健医药科技有限公司，批号：CX0012)；地塞米松片(DXM，浙江仙琚制药股份有限公司，批号：200402)。羧甲基纤维素钠(CMC-Na，国药集团化学试剂有限公司，批号：20180412)；丙二醛(MDA，批号：A003-1-1)、过氧化氢(H2O2，批号：A064-1-1)、总超氧化物歧化酶(T-SOD，批号：A001-1-2)、还原型谷胱甘肽(GSH，批号：A006-1-1)和过氧化氢酶(CAT，批号：A007-1-1)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号：20200602)、白细胞介素-1β(IL-1β，批号：SEKR-0002)、IL-6(批号：SEKR-0005)、血管内皮生长因子(VEGF，批号：SEKR-0032)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α，批号：SEKR-0009)测定试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2仪器 多功能动态热回流提取浓缩机组(上海矩源设备有限公司，型号：JYT-50LN)；可调旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂，型号：RE-52A)；冷冻干燥机(西班牙公司，型号：Telster LyoQuest-55 plus)；模拟高原低压低氧动物实验舱群(贵州风雷航空军械有限责任公司，DYC-9070)；电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂，101-2-S)；全自动样品快速研磨仪(上海净信实业发展有限公司，Tissuelyser-24)；制冰机(意大利斯科茨曼，AF-80)；Sigma 3K15高速冷冻离心机(德国Sigma公司，3K15)；全自动荧光酶标仪(美国Molecular 公司，SpectraMax i3)；水平摇床振荡器(上海旌派仪器有限公司，TYZD-BS)；正置显微镜(甘肃嘉瑞贸易有限责任公司，BX40)。

1.3实验动物 SPF级Wistar雄性大鼠80只，体质量180～220 g，购买于联勤保障部队第九四〇医院动物实验科，生产许可证号：SCXK(军)2017-0023。动物饲养于联勤保障部队第九四〇医院动物实验科，使用许可证号：SYXK(军)2017-0047。大鼠于恒温(20～25 ℃)、恒湿(40%～50%)及12 h明暗交替条件下自由摄食进水。本研究经伦理委员会批准(2020KYLL064)。

1.4方法

1.4.1动物分组与模型制备[13]：80只SPF级Wistar雄性健康大鼠在动物实验科适应饲养3 d后，随机分为常氧空白组(NG组)，缺氧模型组(HG组)，贯叶金丝桃提取物低(HPE-L，100 mg/kg)、中(HPE-M，200 mg/kg)、高(HPE-H，400 mg/kg)剂量组，金丝桃苷低(HYP-L，50 mg/kg)、高(HYP-H，100 mg/kg)剂量组和DXM组(4 mg/kg)，每组10只。各组大鼠灌胃用药均用0.5% CMC-Na助溶。5%苦味酸皮毛染色以标记大鼠。NG和HG组大鼠以0.5% CMC-Na(10 ml/kg)灌胃，其余6组按相应剂量灌胃给药，连续给药7 d，第4天起除NG组外，其余各组均置于模拟海拔7500 m高原环境的模拟舱中饲养72 h。实验人员每天上午8：30进入实验舱后，将实验舱以2 m/s匀速上升至海拔高度4000 m，同时模拟舱以10 m/s匀速下降至海拔高度4000 m，当两舱体稳定后，实验者进入模拟舱，进行灌胃给药，换食水和垫料。每次给药后，模拟舱恢复海拔7500 m的高原环境，实验舱恢复当地海拔高度。期间，动物自由摄食饮水，同时观察大鼠生存状态，末次给药1 h后在实验舱进行大鼠样本取材。

1.4.2动物取材：各缺氧组大鼠缺氧72 h后，断头处死，打开胸腔，小心摘取完整肺组织并分为左肺和右肺，左肺上叶组织滤纸拭干残血后用于肺含水量的测定，左肺下叶及右肺组织用预冷的生理盐水冲洗残血，滤纸拭干。左肺下叶组织低温保存用于其他指标的测定，右肺组织浸泡于4%多聚甲醛中，用于HE染色。NG组同一时间按上述方法在常氧条件下取材。

1.4.3大鼠肺含水量测定：肺组织含水量检测采用干湿比重法。将分离出的左肺上叶组织放入55 ℃电热恒温鼓风干燥箱中，直至干重称量误差在0.0 002 g内，根据公式：含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%，计算大鼠肺含水量。

1.4.4大鼠肺组织病理学观察：大鼠完整右肺组织用4%多聚甲醛溶液室温充分展开固定。固定好后，常规脱水，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色(HE)，并于正置显微镜下放大200倍观察肺组织病理学变化。

1.4.5大鼠肺组织匀浆液中氧化应激指标和炎性因子测定：取低温保存的大鼠左肺下叶组织适量，加入9倍体积的预冷生理盐水，用研磨仪充分匀浆，制成10%肺组织匀浆，并于4 ℃下4000 r/min离心15 min。BCA法测定肺组织匀浆液中蛋白质含量，根据各试剂盒说明书测定肺组织中MDA、GSH和H2O2的含量及T-SOD、CAT活力。应用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)测定大鼠肺组织中IL-1β、IL-6、VEGF和TNF-α含量。

2 结果

2.1肺含水量 NG组、HG组、HPE-L组、HPE-M组、HPE-H组、HYP-L组、HYP-H组和DXM组肺含水量分别为(47.22±0.04)%、(52.16±0.03)%、(49.25±0.03)%、(48.47±0.04)%、(47.41±0.04)%、(49.20±0.03)%、(48.28±0.08)%、(47.07±0.04)%。与NG组比较，HG组大鼠肺含水量升高(P<0.01)。与HG组比较，药物组大鼠肺组织含水量降低，其中，HPE-M组、HPE-H组、HYP-L组及DXM组肺组织含水量显著降低(P<0.01，P<0.05)。

2.2肺组织病理学观察 NG组大鼠肺组织结构规则，肺泡腔清晰，无明显水肿、炎症等病理损伤。与NG组比较，HG组大鼠肺组织损伤明显，结构完整性被破坏，肺泡壁明显增厚，肺间质有充血、水肿现象。与HG组比较，HPE组、HYP组及DXM组肺组织病理结构改善，肺泡壁增厚减轻，肺泡腔扩张并趋于正常。其中HPE-M组、HPE-H组、HYP-L组、HYP-H组及DXM组肺组织结构改善较明显，肺泡壁稍增厚，炎症反应减轻。见图1。

图1 各组大鼠肺组织病理学变化(HE×200)

2.3肺组织中MDA、H2O2、T-SOD、GSH和CAT水平 与NG组比较，HG组大鼠肺组织匀浆液中MDA和H2O2含量显著升高，GSH含量及T-SOD、CAT活力显著降低(P<0.01，P<0.05)。与HG组比较，HPE-M组、HPE-H组、HYP-L组、HYP-H组和DXM组大鼠肺组织匀浆液中MDA含量显著下降，T-SOD活力显著上升(P<0.01，P<0.05)；与HG组比较,HPE-M组、HYP-L组和HYP-H组大鼠肺组织匀浆液中H2O2含量显著下降,HPE-H组、HYP-L组、HYP-H组和DXM组大鼠肺组织匀浆液中GSH含量显著上升,HPE-M组、HPE-H组、HYP-H组和DXM组大鼠肺组织匀浆液中CAT活力升高(P<0.01，P<0.05)。见表1。

表1 贯叶金丝桃提取物对高原缺氧大鼠肺组织中氧化应激指标的影响

2.4肺组织中IL-1β、IL-6、VEGF和TNF-α水平 与NG组比较，HG组大鼠肺组织匀浆液中IL-1β和VEGF的含量显著升高(P<0.01)。与HG组比较，HPE-L组、HPE-M组、HPE-H组、HYP-L组、HYP-H组和DXM组大鼠肺组织匀浆液中IL-1β和VEGF含量显著降低(P<0.01,P<0.05)。与HG组比较，HPE-H组、HYP-L组、HYP-H组和DXM组IL-6含量显著下降，HYP-H组和DXM组TNF-α含量显著下降(P<0.01,P<0.05)。见表2。

表2 贯叶金丝桃提取物对缺氧大鼠肺组织中炎性因子的影响

3 讨论

HAPE的易感性和发展与炎症、缺氧有关。在一项随机临床试验中发现，有HAPE病史的受试者在接受DXM治疗时，表现出抵抗肺水肿发展的能力[14]。KUBO等[15]研究发现，IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α在早期HAPE中起作用，并可能与肺动脉高压有关。炎症反应中氧消耗增加，大量活性氧(ROS)中间体产生，局部营养物质耗竭，从而导致严重的组织缺氧[16]。ROS调节免疫因子的信号级联通路，其水平升高可以促进炎性因子的产生，同样，炎性因子的增加可以刺激自由基的产生。因此，在HAPE致病条件下，缺氧和炎症有着密切的联系[17]。

本研究结果显示，缺氧72 h后，与NG组比较，HG组大鼠肺组织损伤明显，肺泡壁增厚明显，肺间质伴有充血、水肿，肺含水量明显升高，说明HAPE模型建立成功。HPE与HYP灌胃给药后发现，与HG组比较，药物组大鼠肺含水量下降，其中，HPE-M组、HPE-H组、HYP-L组和DXM组下降最显著。同时，药物组大鼠肺组织结构得到显著改善，肺泡壁增厚缓解，肺泡腔扩张并趋于正常，炎症反应减轻，其中，HPE-M组、HPE-H组、HYP-L组、HYP-H组及DXM组改善较明显。

ROS是一组不稳定且具有高度活性的含氧分子，包括H2O2、超氧阴离子自由基(O2·-)和羟基自由基(·OH)。在氧化磷酸化过程中ROS由呼吸链以O2·-的形式不断产生，O2·-通过SODs转化为H2O2。相对于ROS的其他成员，非自由基的H2O2可以不受限制地通过细胞膜，并与亚铁相互作用，产生具有高度破坏性的·OH[18]。MDA是膜损伤和机体衰老的重要指标，是由ROS增加而产生的有毒物质，其可以与生物大分子反应，改变细胞膜的流动性和通透性，最终改变细胞的结构和功能[19]。ROS过度产生导致氧化应激，会对细胞中的DNA、蛋白质和脂质造成损害，从而导致各种病理状况[20-21]。CAT是一种抗氧化酶，防止H2O2的累积，将其分解为O2和H2O，并参与人类疾病的许多病理生理过程，对人体的生长发育和代谢活动具有重要的意义[22]。GSH参与机体内三羧酸循环及糖代谢，具有抗氧化作用和整合解毒作用，可保持机体正常的免疫系统功能[23]。SOD是直接清除自由基的酶，其以高特异性和高效率将超氧化物歧化为O2和H2O2，其在维持细胞健康方面发挥着重要的作用[24]。本研究结果表明，与NG组比较，HG组大鼠肺组织中MDA和H2O2含量升高，T-SOD、CAT活力及GSH含量下降，提示在7500 m模拟高原环境下，大鼠肺组织氧化还原平衡状态被打破，受到氧化应激损伤。药物干预后，缺氧大鼠肺组织中MDA和H2O2含量下降，T-SOD、CAT活力及GSH含量升高，提示HPE和HYP可有效改善HAPE大鼠肺组织氧化应激损伤。

在创伤中，体内发生感染，巨噬细胞被激活，产生并释放大量的TNF-α，其可损伤血管内皮，破坏屏障功能，致毛细血管通透性增加，大量液体渗出，形成肺水肿。TNF-α可减少抗氧化剂的产生，降低机体清除氧自由基的能力，进一步加重组织损伤。IL-6是诱发炎症级联反应的关键炎性因子，主要由T细胞、单核-巨噬细胞和内皮细胞分泌，可导致长期慢性炎症。IL-1β是IL-1的一种亚型，是介导炎症反应的重要细胞因子，具有广泛的免疫调节作用。VEGF是机体内最强的血管通透性因子，可增加肺血管内皮细胞的通透性，加重HAPE，扩大机体的炎症反应[25]。本研究结果显示，HG组大鼠肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α和VEGF含量较NG组升高，主要原因可能是缺氧后大鼠肺组织中大量ROS中间体产生，进而促进炎性因子的释放，炎性因子的增加又刺激自由基的产生，调节氧化应激相关通路。药物干预后，HPE和HYP各剂量组大鼠肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α和VEGF的含量均下降，提示HPE的抗炎活性可能与下调HAPE大鼠肺组织中炎性因子的含量，恢复炎症反应的平衡有关。

综上所述，HPE能有效改善缺氧损伤大鼠高原肺水肿，保护大鼠肺组织免受氧化应激和炎性因子的损害。贯叶金丝桃有望开发成为治疗HAPE的药物制剂，其具体调节通路还有待进一步研究。