miR-199-3p过表达调控肺癌A549细胞生长、侵袭及上皮间质转化机制研究

熊伟杰,王云涛,何 朗

肺癌是发病率和病死率增长最快的恶性肿瘤之一，可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，当发生继发性多器官转移时，约75%处于疾病晚期[1]。既往文献报道，肺癌5年生存率仅为5%～10%[2]。在分子水平上，肺癌由一系列遗传和表观遗传学改变引起，这些改变使肿瘤抑制基因失活并激活癌基因[3]。了解肺癌发生发展的分子机制将有助于提高诊断、治疗和预防水平。miRNA在包括细胞增殖、细胞凋亡、信号转导和致癌在内的各种生物学过程中起着关键作用[4]。相关研究表明，miR-199-3p抑制肝癌MHCC97H细胞的增殖、迁移[5]，促进骨肉瘤细胞凋亡[6]，抑制膀胱癌细胞增殖[7]。已有研究表明，miR-199a-3p能通过负调控CBX7抑制肺癌A549细胞的发展[8]。本研究旨在探究miR-199-3p靶向SOX5对肺癌细胞A549生长、侵袭能力及上皮间质转化(EMT)的影响。

1 材料与方法

1.1试剂 RRPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶和青-链霉素均购自美国赛默飞世尔科技公司；人肺癌A549细胞购自美国典型培养物保藏中心；miR-485-5p模拟物、SOX5过表达载体、SOX5空载体均购自上海吉玛制药有限公司；BCA试剂盒购自上海吉至生化科技有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；细胞凋亡检测试剂盒购自上海雅吉生物科技有限公司；Transwell购自美国康宁公司；一抗Ki-67、PCNA、Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved Caspase-3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin购自英国Abcam公司。

1.2细胞培养 A549细胞于37 ℃，5% CO2恒温培养箱用高糖RMPI 1640培养基(含10% FBS和1%青-链霉素)培养，取对数生长期细胞用于实验，0.25%胰蛋白酶消化。

1.3荧光素酶报告实验 通过生物信息学网站(http://www.targetscan.org/)预测SOX5和miR-199-3p的结合位点，选用荧光素酶报告分析，构建野生型(WT)和突变型(MUT)SOX5 3' UTR荧光素酶报告基因重组质粒转染至A549细胞。根据试剂盒说明书检测荧光素酶相对活性。

1.4RT-PCR 收集转染后的A549细胞，按TRIzol法提取细胞总RNA，根据逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA并建立20 μl反应体系，反应条件为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环，72 ℃ 10 min。以U6和GAPDH为内参，用2-ΔΔCt方法进行定量计算。

1.5SOX5过表达 将A549细胞按随机数字表法分为对照组(Control组)、pcDNA组和pcDNA-SOX5组。Control组不作处理，pcDNA组转染空质粒载体，pcDNA-SOX5组转染SOX5 pcDNA质粒载体，通过RT-PCR和Western blot测定SOX5 mRNA水平和蛋白表达水平验证SOX5过表达是否成功。

1.6细胞分组 将细胞随机分为Control组、miR-199-3p过表达组(mimic组)、SOX5过表达组(SOX5组)和mimic+SOX5组。Control组不做任何处理，mimic组转染miR-199-3p mimic，SOX5组转染SOX5 pcDNA载体，mimic+SOX5组同时转染miR-199-3p mimic和SOX5 pcDNA载体。

1.7克隆形成法检测细胞增殖 将A549细胞接种于6孔板(500个/孔)，按方法“1.6”分组，待出现肉眼可见的克隆时，多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色，显微镜下计数克隆形成数计算克隆形成率。

1.8流式细胞仪检测细胞凋亡率 取转染后的各组A549细胞接种于6孔板，培养48 h后，室温下加入5 μl Annexin V-FITC混匀，最后加入碘化丙啶(PI)10 μl避光孵育15 min，检测细胞凋亡率。

1.9Transwell检测细胞侵袭情况 于Transwell上室添加无血清培养基稀释的人工基底膜，取转染后的各组A549细胞，上室中加入100 μl细胞悬液，下室中加入600 μl含FBS的RMPI 1640培养液。培养24 h后脱脂棉擦掉基质胶和上室细胞，4%多聚甲醛溶液固定20 min，0.1%结晶紫染色。光学显微镜下计数并拍照，每个样本随机选取5个视野。

1.10EMT形态学观察 取各组转染后A549细胞接种于6孔板过夜培养，显微镜下观察各组细胞形态变化。

1.11Western blot检测Ki-67、PCNA、Bax、Bcl-2、Caspase-3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平 各组A549细胞裂解提取总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白含量。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，200 mA恒流电转移至聚偏氟乙烯膜。加入一抗Ki-67(1∶1 000)、PCNA(1∶1000)、Bax(1∶1000)、Bcl-2(1∶1000)、Caspase-3(1∶1000)、E-cadherin(1∶1000)、N-cadherin(1∶1000)和Vimentin(1∶1000)4 ℃下孵育过夜，TBST缓冲液清洗后加入辣根过氧化物酶标记的IgG(1∶10 000)，最后发光成像。ImageJ 软件分析蛋白水平。

2 结果

2.1miR-199a-3p与SOX5靶向关系 与Control组比较，mimic组A549细胞miR-199a-3p mRNA水平升高，SOX5 mRNA水平降低(P<0.05)，见图1。与SOX5 WT、SOX5 MUT、SOX5 MUT+mimic组比较，SOX5 WT+mimic组荧光素酶活性降低(P<0.05)，见图2。

图1 RT-PCR检测A549细胞miR-199a-3p及SOX5表达水平

图2 双荧光素酶报告实验检测miR-199a-3p与SOX5荧光素酶活性

2.2SOX5过表达对SOX5 mRNA和蛋白表达的影响 与Control组比较，pcDNA-SOX5组A549细胞SOX5 mRNA和蛋白水平升高(P<0.05)。见图3。

图3 SOX5过表达对SOX5 mRNA水平和蛋白表达水平的影响

2.3miR-199a-3p靶向SOX5对A549细胞增殖的影响 与Control组比较，mimic组A549细胞克隆形成率降低，SOX5组A549细胞克隆形成率升高(P<0.05)；与SOX5组比较，mimic+SOX5组A549细胞克隆形成率降低(P<0.05)。见图4。与Control组比较，mimic组A549细胞Ki-67、PCNA蛋白表达水平降低，SOX5组A549细胞Ki-67、PCNA蛋白表达水平升高(P<0.05)；与SOX5组比较，mimic+SOX5组A549细胞Ki-67、PCNA蛋白表达水平降低(P<0.05)。见图5。

图4 miR-199a-3p靶向SOX5对A549细胞增殖的影响

图5 miR-199a-3p靶向SOX5对A549细胞Ki-67、PCNA蛋白表达的影响

2.4miR-199a-3p靶向SOX5对A549细胞凋亡的影响 与Control组比，mimic组A549细胞凋亡率升高，SOX5组A549细胞凋亡率降低(P<0.05)；与SOX5组比，mimic+SOX5组细胞凋亡率升高(P<0.05)。见图6。与Control组比，mimic组A549细胞Bax/Bcl-2比值和cleaved Caspase-3/Caspase-3比值升高，SOX5组A549细胞Bax/Bcl-2比值和cleaved Caspase-3/Caspase-3比值降低(P<0.05)；与SOX5组比，mimic+SOX5组A549细胞Bax/Bcl-2比值和cleaved Caspase-3/Caspase-3比值升高(P<0.05)。见图7。

图6 miR-199a-3p靶向SOX5对A549细胞凋亡的影响

图7 miR-199a-3p靶向SOX5对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响

2.5miR-199a-3p靶向SOX5对A549细胞侵袭的影响 与Control组比较，mimic组A549细胞侵袭数降低，SOX5组A549细胞侵袭数升高(P<0.05)。与SOX5组比较，mimic+SOX5组A549细胞侵袭数降低(P<0.05)。见图8。

图8 miR-199a-3p靶向SOX5对A549细胞侵袭的影响

2.6miR-199a-3p靶向SOX5对A549细胞EMT的影响 Control组A549细胞可见形态为连接松散的类圆或纺锤体样，黏附力低，细胞由上皮向间质转化，而mimic+SOX5组EMT形态变化少于SOX5组。提示miR-199a-3p过表达抑制上皮间质细胞转化。与Control组比较，mimic组A549细胞E-cadherin蛋白表达升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表达降低，而SOX5组A549细胞E-cadherin蛋白表达降低，N-cadherin和Vimentin蛋白表达升高(P<0.05)。与SOX5组比较，mimic+SOX5组A549细胞E-cadherin蛋白表达升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表达降低(P<0.05)。见图9。

图9 miR-199a-3p过表达对A549细胞EMT的影响

3 讨论

肺癌在我国发病率和病死率极高[9-11]。随着分子生物学的发展，新的肿瘤标志物和治疗靶点为肺癌的诊断和治疗提供了新的方向。SOX5与淋巴瘤、乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌等的发生发展密切相关[12]。SOX5蛋白参与胚胎发育、神经生长、干细胞形成等生长发育过程，是细胞分化的调控者[13]。

本研究发现，miR-199a-3p过表达靶向抑制SOX5具有降低A549细胞Ki-67、PCNA蛋白表达水平的作用。癌细胞的过度增殖是肿瘤发生与发展的重要因素之一。Ki-67和PCNA是与细胞增殖相关的核抗原，近年来被广泛应用于检测细胞增殖，PCNA为DNA聚合酶辅助蛋白，与细胞增殖密切相关[14]。Ki-67水平可反映细胞的增殖状态，其高表达促进肿瘤细胞增殖[15]。张丽娟等[16]研究发现，miR-199a-3p过表达可降低卵巢癌SK0V3细胞的增殖能力。提示miR-199a-3p过表达靶向抑制SOX5可抑制A549细胞增殖。本研究发现，过表达miR-199a-3p靶向SOX5后，A549细胞Bax/Bcl-2和cleaved Caspase-3/Caspase-3上调。细胞凋亡属于程序性细胞死亡，可通过消除旧的及受损细胞维持生物机体内生理平衡，Caspase-3属于凋亡蛋白，抑制Caspase-3蛋白活性可阻断凋亡途径起到抑制凋亡的作用[17]。Bax发挥促凋亡作用，Bcl-2发挥抗凋亡作用，二者相互作用，可形成异源二聚体可调控细胞凋亡[18]。有研究报道，miR-199a-3p可通过抑制视网膜母细胞瘤1诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡[19]。提示miR-199a-3p过表达靶向抑制SOX5可促进A549细胞凋亡。

本研究结果显示，过表达miR-199a-3p靶向SOX5后，A549细胞侵袭能力降低。陶良俊[20]研究发现，过表达miR-199a-3p可抑制肾癌细胞786-0的增殖、存活和侵袭。QU等[21]研究发现，miR-199a-3p通过靶向Smad1抑制前列腺癌细胞的增殖和侵袭。提示miR-199a-3p过表达靶向抑制SOX5可抑制A549细胞侵袭。

本研究发现，过表达miR-199a-3p靶向SOX5后，A549细胞E-cadherin蛋白表达升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表达降低。EMT是发生在伤口愈合和癌变过程中的一种上皮细胞失去其分化表型获得间质细胞特征的生物学过程[22]。当细胞发生EMT时，E-cadherin下调，N-cadherin和Vimentin表达上调，可用于判断EMT的发生[23]。提示过表达miR-199a-3p可靶向SOX5抑制A549细胞EMT。

综上所述，miR-199a-3p表达升高可抑制肺癌A549细胞增殖、侵袭和EMT，并促进细胞凋亡，这可能是通过靶向抑制SOX5表达实现的。以miR-199a-3p为靶点的干预治疗有望成为抑制肺癌A549细胞侵袭和增殖的新方法。