血清miR-23a、miR-30a与2型糖尿病合并骨质疏松的相关性

麦小青，陈邢玉，陈达健，宋科秀

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以骨量低下、骨微结构损坏，导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性骨病。糖尿病是一种常见的全身代谢性内分泌疾病，其中2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)占糖尿病的90%以上。OP是T2DM的常见并发症，有文献报道，随着T2DM患者寿命及病程的延长，T2DM合并OP的发病率呈增加趋势[1]。T2DM合并OP是骨骼系统出现的严重慢性并发症，也是引发持久功能障碍的主要因素，其发生骨折的风险显著高于普通人群[2]。miR-23a与一些肿瘤的发生发展具有密切联系。有研究证实，miR-23a能够下调碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白基因的表达，参与调控骨代谢[3]。研究发现miR-30a在关节炎患者软骨组织中呈高表达，且可靶向作用于Akt基因进而诱导软骨细胞凋亡[4]。近年来相关研究报道，miR-23a、miR-30a分别在原发性痛风性关节炎及大鼠骨质疏松症发展过程中起重要作用[5]。同时研究显示，miR-30a与T2DM并重症肾衰竭患者病情程度有关[6]。因此，本研究通过分析miR-23a、miR-30a与T2DM合并OP的相关性，以寻找诊断T2DM合并OP的相关生物学指标。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年10月—2019年10月于本院确诊的T2DM 135例。纳入标准：T2DM的诊断符合1999年WHO颁布的糖尿病诊断标准[7]；OP诊断符合1994年WHO制定的关于OP分类和诊断指南；临床资料完整者；所有受试者及家属均知情同意并签署知情同意书。排除标准：长期营养缺乏、低钙饮食者；近期服用影响骨代谢的药物及其他代谢性骨病；合并肿瘤、血液系统、结缔组织疾病者；合并心肝肾疾病者。将合并OP 70例作为OP组，未合并OP 65例作为无OP组；另选取未合并T2DM的OP 70例作为单纯OP组，同期入院体检的正常志愿者70例作为对照组。4组性别、年龄等方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1样本采集与保存：所有受试者于清晨空腹抽取静脉血5 ml，3000 r/min离心5 min，离心半径9 cm，分离血清，于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2qRT-PCR法检测血清miR-23a、miR-30a水平:采用Trizol法提取血清中总RNA，操作步骤严格按照Trizol试剂盒说明书进行。应用反转录合成cDNA，反应体系：95 ℃预变性10 s、95 ℃变性5 s、60 ℃退火及延伸34 s，共40个循环。miR-23a、miR-30a均以U6作为内参，采用Folds=2-ΔΔCt计算基因的相对表达量。

1.2.3相关指标检测：①采用双光能X线骨密度仪(Challenger，DMS，France)检测患者骨密度，按照操作要求准确输入患者相关信息，按要求摆放体位，分别记录大转子区域、左侧股骨颈及Wards三角区骨密度值，自动计算T值。②抽取禁食12 h后次日清晨空腹静脉血，离心分离出血清待测，采用全自动生化分析仪测定血清空腹血糖(FBG)；采用全自动电化学发光免疫分析仪检测骨钙素(BGP)、β-胶原降解产物(β-CTX)水平，检测试剂均购自瑞士罗氏公司，所有操作严格按照说明书进行。

2 结果

2.1血清miR-23a、miR-30a表达水平 OP组血清miR-23a、miR-30a水平高于对照组、单纯OP组及无OP组(P<0.05)。见表1。

表1 4组血清miR-23a、miR-30a表达水平比较

2.2临床指标 OP组大转子、股骨颈、Wards三角区BMD及BGP、β-CTX均小于无OP组(P<0.01)。见表2。

表2 2组T2DM患者临床指标比较

2.3血清miR-23a、miR-30a水平与临床指标的相关性 血清miR-23a与miR-30a呈正相关(r=0.576，P<0.01)，与大转子、股骨颈、Wards三角区BMD及BGP、β-CTX呈负相关(r=-0.381、-0.593、-0.533、-0.615、-0.582，P<0.05)；miR-30a与大转子、股骨颈、Wards三角区BMD及BGP、β-CTX呈负相关(r=-0.428、-0.624、-0.583、-0.647、-0.560，P<0.05)。

2.4血清miR-23a、miR-30a对T2DM合并OP的诊断价值 血清miR-23a、miR-30a联合诊断T2DM合并OP的AUC高于单独检测(P<0.05)。见表3。

表3 血清miR-23a、miR-30a对T2DM合并OP的诊断价值

2.5T2DM并发OP的危险因素多因素Logistic回归分析 以T2DM患者是否发生OP作为因变量，以miR-23a、miR-30a、BGP、β-CTX为自变量进行非条件二分类Logistic回归分析。根据ROC曲线确定的最佳截断值将血清miR-23a、miR-30a分为高、低水平，变量赋值：miR-23a：低水平=0，高水平=1；miR-30a：低水平=0，高水平=1；大转子BMD：正常=0，降低=1；股骨颈BMD：正常=0，降低=1；Wards三角区BMD：正常=0，降低=1；BGP：正常=0，降低=1；β-CTX：正常=0，降低=1。结果显示，血清miR-23a、miR-30a水平升高为T2DM患者并发OP的危险因素(P<0.01)。见表4。

表4 T2DM并发OP的危险因素多因素Logistic回归分析

3 讨论

糖尿病是临床常见的慢性代谢性疾病，常伴有微血管并发症，影响患者血液循环及骨骼中的血流分布，可能导致骨组织供血不足，且患者多存在高糖及内分泌失调等症状，导致骨组织受损而引发骨代谢异常[8]。有研究显示，T2DM患者发生OP风险高于普通人群，是骨质疏松性骨折发生的危险因素[9]。T2DM合并OP是致残的重要原因之一，因此，T2DM合并OP的早发现早治疗尤为重要[10]。

miR-23a能够在转录后发挥调解作用[11]。已有研究证实，miR-23a参与包括神经系统、消化系统等多种癌症的发生与发展[12]。此外miR-23a能够调控细胞的正常生长和分化，有学者发现，miR-23在骨骼肌中的表达水平较高，其参与骨骼肌的发育过程[13]。miR-23a在细胞分化及骨代谢等相关方面已有一定的研究，但其与T2DM合并OP的关系研究较少[14]。本研究显示，OP组血清miR-23a、miR-30a水平高于对照组、单纯OP组及无OP组，提示miR-23a参与T2DM合并OP的发生，可能与miR-23a参与细胞的分化有关。在非小细胞肺癌组织中，miR-30a表达下降，起到抑癌基因作用，能够抑制癌细胞的转移。有研究发现，miR-23a与miR-30a在炎症环境下牙周骨组织中表达上调，提示miR-23a与miR-30a参与调控炎症环境下骨代谢和成骨细胞活性[15]。在细胞分化和发展过程中，骨关节炎患者miR-30a表达上调，通过靶向调节Sox9和下游产物促进细胞外基质的降解。miR-30a参与细胞的分化过程，且与骨代谢等关系密切，但与T2DM患者并发OP的关系研究较少。本研究结果显示，T2DM合并OP患者血清miR-30a表达上调，提示miR-30a参与T2DM合并OP的发生，推测miR-30a可能作用于T2DM患者细胞成骨分化的过程，从而参与到成骨细胞分化的多种生长因子的调控，与T2DM合并OP的发生有关，而与单纯OP的发生无关。分析原因可能是临床影响因素较多，如样本量偏小可能导致结果有一定偏倚，为深入分析miR-30a与骨代谢的具体作用机制还应在大样本基础上继续探究。

BGP为成骨细胞产生的特异性蛋白，能够募集、趋化并激活破骨细胞，调节骨吸收。β-CTX是最稳定的骨吸收标志物，且敏感度较高。本研究结果显示，T2DM合并OP患者大转子、股骨颈、Wards三角区BMD及BGP、β-CTX均低于未合并OP患者，且miR-23a、miR-30a均与大转子、股骨颈、Wards三角区BMD及BGP、β-CTX呈负相关，miR-23a与miR-30a呈正相关，提示血清miR-23a、miR-30a参与T2DM合并OP的发展，且与患者临床病理特征密切相关。本研究结果显示，miR-23a和miR-30a联合诊断T2DM合并OP的敏感度、特异度均较高。提示miR-23a、miR-30a二者联合检测对T2DM并发OP具有一定诊断价值，能够作为诊断T2DM并发OP的潜在生物学指标。多因素Logistic回归分析结果显示，miR-23a、miR-30a为T2DM患者并发OP的危险因素，提示血清miR-23a、miR-30a高表达可能造成T2DM患者骨骼分化能力减弱，从而导致骨密度降低，最终致OP的发生。

综上所述，T2DM合并OP患者血清miR-23a、miR-30a水平上调，与T2DM合并OP患者骨密度等临床指标相关，是T2DM合并OP独立危险因素，二者联合检测对T2DM合并OP有一定诊断价值。