铁电极辅助餐厨垃圾高温厌氧消化及微生物的耐盐机理

2022-04-26曲艺源张景新何义亮

化工进展 2022年4期

曲艺源，张景新，何义亮

（上海交通大学中英国际低碳学院，上海 201306）

在厌氧消化过程中，温度是影响厌氧消化性能的重要因素之一。一般而言，厌氧消化主要分为中温（35～37℃）厌氧消化和高温（55～60℃）厌氧消化。在高温厌氧消化过程中，有机物的水解速率、挥发性固体的去除率和产甲烷量比中温厌氧消化高。并且在高温条件下，消化底物中的病原体更少。但是，高温菌比中温菌对环境的变化更为敏感。当环境中的NaCl 浓度发生变化时，细胞的活性会受到影响，参与厌氧消化的酶活性下降，同时，高盐度会使细胞渗透压增加，导致微生物发生细胞的质壁分离进而导致微生物细胞的死亡。因此，缓解高盐度对微生物的不良影响对高温厌氧消化性能的提升具有重要意义。

近年来很多研究表明，添加零价铁（ZVI）能够提高厌氧消化的稳定性、微生物的耐盐能力和细胞活性。大量研究表明，铁-碳微生物电解池（MEC）在有机污染物降解、工业废水和有机废水处理过程中具有强化厌氧消化的作用。并且已有研究表明，ZVI与MEC耦合之后能够促进微生物的直接种间电子传递（DIET），提高系统的产甲烷能力。但是在高温、高盐度条件下，ZVI 耦合MEC的厌氧消化系统能否提高微生物的耐盐能力、提高甲烷产量以及在电化学系统中铁作为阳极形成的生物膜的微生物结构和强化机制尚不清楚。

本文研究了不同Na浓度的条件下MEC在高温厌氧消化过程的强化效果，对微生物的群落结构变化和代谢通路进行了分析评估并解释其耐盐机理。本研究对强化厌氧消化过程实现能源回收以及含盐废弃物处理具有重要指导意义。

1 材料和方法

1.1 材料

接种污泥取自嘉兴某生物处理厂的大型厌氧消化罐，餐厨垃圾取自上海市宜浩欧景人才公寓的食堂，主要由大米、面条、肉和蔬菜组成。将餐厨垃圾搅碎并通过混合器均匀混合，接种污泥和餐厨垃圾的特性如表1所示。

表1 接种污泥和餐厨垃圾的元素组成、总固体（TS）和挥发性固体（VS）

1.2 实验装置和操作

采用300mL 厌氧玻璃瓶构建单室电发酵反应器。阴极为石墨电极、阳极为铁电极制成铁-碳微生物电解池（R1），阴极、阳极均为石墨电极的碳-碳微生物电解池（R2），对照组（C）不使用微生物电解池，并设置三组平行组。加入由厌氧消化池采集的240mL 接种污泥，恒电位设置为0.6V。添加餐厨垃圾的有机负荷为4g VS/L，每次改变盐度添加一次餐厨垃圾，并用NaCl 分别调节Na浓度分别为0、5g/L、10g/L、15g/L 和20g/L，每6 天添加一次餐厨垃圾并改变盐度，在Na浓度为20g/L 时实验重复进行3 次，以验证耐盐效果。为了保持严格的厌氧消化，用氮气冲洗100 次，脱去氧气后，用铝箔集气袋密封连接，保持厌氧状态。pH 调整为6.97，反应器在(55±1)℃的水浴条件下运行，测定Fe、pH、产甲烷量、COD 和挥发性脂肪酸（VFAs）。

1.3 分析方法

（1）VFAs测定上清液中VFAs测定采用气相色谱法。样品预处理：采用3%的磷酸酸化上清液至pH 到4.00 以下，确保上清液中小分子酸处于解离状态，盛装于2mL 分析瓶中。采用岛津气相色谱仪（GC-2030），色谱柱温度60℃，氢火焰离子化检测仪（flame ionization detector，FID）温度250℃。乙酸、丙酸、丁酸（异丁酸）和戊酸（异戊酸）对应COD 的转换系数分别为1.07、1.51、1.82、2.04。

（2）宏基因组学分析取铁片电极上的生物膜和R1 和C 反应器中实验后的底泥，向其中加入同体积无水乙醇进行固定，随后置于-20℃的冰箱中保存。将样品送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行DNA提取和测序，并进行宏基因组分析。使用引物（TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTC）和（TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTC）分别对古菌和细菌进行16S rRNA的扩增。采用高通量测序仪进行高通量测序，得到基因序列通过软件被分成各种OTU。最后利用GreenGenes 和NCBI 数据库对得到的OTUs 进行分类，并且进行代谢通路分析。根据数据库中已有测序微生物基因组的基因功能构成和测序获得的物种构成推测样本中的功能基因构成。

（3）其他相关测定指标及方法 pH，玻璃电极法；TS，重量法；VS，灼烧减量法；COD，快速消解分光光度法；气体成分，气相色谱法；Fe浓度，邻菲啰啉分光光度法。

2 结果与讨论

2.1 产甲烷量对比分析

不同NaCl 浓度下体系的累积甲烷量如图1 所示。在未添加NaCl 的情况下，R1的强化效果比较明显。将Na浓度提高时，R1 产甲烷能力开始下降。添加5g/L Na时，R1反应更快，最高甲烷产量为92mL/g VS，是R2 和C 的1.91 倍和1.84 倍。当Na的含量分别进一步增加到10g/L 和15g/L 时，各反应器的产甲烷能力都不同程度地受到了抑制，这说明NaCl的存在能够抑制甲烷的产生。但是R1反应器依旧拥有最高的甲烷产量90～120mL/g VS，并且累积产甲烷量最多，在第24 天的时候达到了928.71mL。当Na浓度达到20g/L 的时候，R1 的比甲烷产量以及累积甲烷产量均最高，比甲烷产量为41.71mL/g VS，分别是R2 和C 反应器的1.52 倍和1.58 倍。对照组（C）的比甲烷产量并不是在每个盐度的第一天达到最大，相对于R1 出现了滞后现象，说明盐度对高温产甲烷过程产生了强烈的抑制作用。就累积产甲烷量而言，在R1反应器中，Na投加量从5g/L 增加到20g/L，对应累积产甲烷量最高达到了1110.67mL，相对于R2 和C 反应器的789.31mL 和660.32mL，分别提高了40.68% 和68.18%。实验结果表明铁-碳微生物电解池能够提高微生物耐盐能力，促进厌氧消化产甲烷。

图1 不同反应器中的甲烷产量对比

2.2 不同盐度下的COD、pH和Fe含量的变化

厌氧消化实验结束后，对照反应器内的COD浓度为(11500±165)mg/L，如图2 所示。R2 和R1 反应器内消化污泥的COD 浓度分别为(9120±75)mg/L和(8574±83)mg/L。从图2 中可以看出，当Na浓度为0 的时候，微生物还处于适应阶段，COD 较高，随着盐度的增加，COD 的去除效果从10g/L Na之后开始下降。对比不同反应器可以看出，C反应器的COD去除效果最差，Na浓度为10g/L，各反应器的去除效果最好，而Na浓度＞10g/L 的时候，各反应器开始出现不稳定现象，但是R1、R2能够克服盐度带来的不利影响。由此可以看出，铁-碳微生物电解池在高盐度条件下具有促进COD 去除和维持高温系统稳定性的作用。应当指出的是，Na浓度20g/L时，COD 去除效果最差，盐度的提高对于COD 的去除具有不利影响，这一结果与之前报道的相一致。相应地，pH 随着Na浓度的增加开始下降，当Na浓度为20g/L 的时候，R1 稳定在7 的水平，但是R2 低于7，而C 的pH 接近6 并且出现酸化的问题，说明盐度对于高温厌氧消化具有很强的抑制作用，而铁-碳微生物电解池在高盐度条件下对于维持厌氧反应器的系统稳定和缓解反应器酸化具有重要作用。

图2 不同反应器中COD的含量和pH变化

Fe在厌氧消化过程中的浓度变化情况如图3所示。可以看出，Fe在溶液中的浓度随着盐浓度的上升在Na为10g/L的时候达到最大值4～5mg/L，然后随着盐度的不断提高逐渐达到一个稳定状态，维持在2～3mg/L。对比固体中铁含量来看，固体中的铁含量同样在Na为10g/L 的时候达到峰值，而产甲烷量同样在此段时间到达最大值，这可能是因为铁能够增强微生物的活性。研究表明铁对于微生物的厌氧消化过程至关重要，它能够参与到关键酶的合成中，并在氧化还原反应中起到电子载体的作用，从而有助于产生更多甲烷。而固体中的铁含量随着盐浓度的升高而降低，可能是因为铁被产甲烷菌利用以提高微生物的产甲烷能力。

图3 Fe含量的变化

2.3 不同盐度下VFAs的变化

VFAs 是厌氧消化的重要中间产物，是产生甲烷的消化底物。如图4所示，将NaCl添加到消化反应器中时，VFAs的产生受到很大影响。当Na浓度从0增加到15g/L时，有机酸降解效率呈下降趋势，Na含量为20g/L 时，有机酸的降解效率最差。铁-碳微生物电解池对VFAs 的降解效果最好，四种酸的总浓度维持在6000mg COD/L 以下。图4 显示了NaCl 对丁酸降解效率的影响。当NaCl 浓度较高的时候，丁酸降解效率降低。随着盐度的增加，对照组的丁酸和丙酸的含量升高，证明盐度升高抑制了挥发性有机酸的乙酸化过程。与对照组相比，R1和R2 反应器能够促进丁酸转乙酸。这些数据表明NaCl 的存在抑制了丙酸和丁酸转化为乙酸，从而抑制了甲烷的产生，而吸附在阳极表面的微生物可以在电的驱动下将有机物氧化为CO。有研究表明，高浓度的Na会导致高渗透压，这可能导致产甲烷菌的细胞内水分流失并降低微生物中关键酶的活性（如脱氢酶）。而通过对比R1和R2可以发现，R2中丙酸的含量是R1的3倍，说明R1能够很好地将丙酸转化为乙酸，这说明铁-碳微生物电解池在促进有机酸的降解、抵抗盐度方面具有更好的效果。并且铁的存在能够调节细胞的渗透压，维持细胞活性，参与关键酶的合成，从而促进产甲烷。这一结果与Feijoo 等报道的利用丙酸的微生物比利用其他有机酸的微生物（如乙酸和丁酸）对高盐环境的适应能力更小一致。

图4 不同厌氧消化系统的有机酸含量对比

2.4 微生物群落分析

2.4.1 盐度对细菌群落结构的影响

厌氧消化系统中属水平群落丰度如图5 所示。在高盐度条件下反应器中出现了一些可降解有机物的耐盐菌。芽孢杆菌（）是能够在高盐条件下生存的细菌，在R1的电极（HFCE）和反应器中的污泥（HFCS）中具有较高的含量，而对照组几乎没有，由此可以看出铁-碳微生物电解能够富集耐盐微生物。互营杆菌属（）是一类产氢产乙酸细菌，在R1的电极（HFCE）的占比大约是对照组中占比的3 倍，有研究报道了能够促进丙酸转乙酸过程，从而促进产甲烷，在有机物降解过程中发挥着关键作用。铁-碳微生物电解池对于耐盐菌的生长有促进作用，并且在高盐度条件下能够促进有机物的水解酸化过程。

2.4.2 盐度对古菌群落结构的影响

从古菌群落结构分析[图5(b)]可知，铁电极（HFCE）上最占优势的菌属是甲基型产甲烷菌属（），该菌属于嗜乙酸型产甲烷菌，是一种耐盐产甲烷菌，可在产甲烷过程受到限制的时候通过甲基还原产生甲烷。R1反应器中，甲烷鬃毛菌属（，又被称为）是一种产甲烷菌，其在HC、HFCE和HFCS 中的占比分别为5%、10%和20%。相比之下，在HC、HFCE 和HFCS 中的占比分别为47%、22%和43%。这一变化可能与接受电子的方式有关，被证明通过DIET将二氧化碳还原为CH。从电极表面接受电子，使用CO还原产甲烷，通过用乙酸脱羧途径产生甲烷。这些结果表明，R1中DIET的刺激增强了二氧化碳产甲烷的转化过程，促进了乙酸型甲烷的生成，而对照组的甲烷生成途径主要是耗氢产甲烷过程。甲烷杆菌属（）是一种以甲酸和H/CO生成甲烷为主要原料的微生物，这可能与铁-碳微生物电解池缓解盐度抑制有关。结果表明，铁-碳微生物电解池可以有效地增强耐盐古菌的富集。在高盐度条件下，这两个微生物群落之间的有利相互作用促进了有机物的降解。

图5 厌氧体系中微生物群落分析

2.4.3 微生物的代谢通路预测

分析微生物群落的代谢通路，可以阐明铁-碳微生物电解池对微生物代谢的影响。将样品所测得的编码基因根据KEGG数据库进行分类比对，样品中二级和三级分类的主要相关编码基因丰度如表2所示。与对照组相比，HFCE 中的细胞生长与死亡、运输和分解代谢以及碳水化合物的代谢相关编码基因分别增加了15.4%、43.4%和31.5%，HFCS细胞生长与死亡、运输和分解代谢以及碳水化合物代谢相关编码基因分别增加了17.9%、23.1%和31.5%。这进一步证实了铁-碳微生物电解池有助于增强细胞和酶的代谢、提高微生物的耐盐能力并且促进餐厨垃圾的水解酸化。通过添加铁-碳电极的形式，负责能量代谢的氧化磷酸化相关编码基因Ko00190 已从376250 增加到HFCE 和HFCS 的491036和458464。Ko00260的基因负责甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢，从183250 增加到346599 和220412，这些基因是参与酶和细胞的合成和代谢过程的必需基因。与产甲烷过程有关的相对丰度的差异最显著的是Ko02024，主要负责甲烷的代谢。HFCE 和HFCS 中的Ko02024 基因数分别为768776和537022，而对照组中仅为486743。Ko02024的增强表明铁-碳微生物电解池有助于促进甲烷化过程。辅酶及维生素的代谢相关编码基因基因丰度从对照组的1111371 增加到HFCE 和HFCS 中的1435909 和1312539，支持了这种相关性。氨基酸代谢相关编码基因丰度从200962 增加到HFCE 和HFCS的240707和242947。从这些基因的变化可以看出，铁在促进微生物的细胞增殖和代谢中起着重要作用，铁能够参与关键酶的合成，能够强化甲烷化过程并且提高微生物的耐盐能力。

表2 KEGG中二级和三级功能分类

2.4.4 甲烷代谢的宏基因组分析

表3 列出了与关键产甲烷途径有关的酶基因。乙酸脱羧和二氧化碳还原是甲烷代谢的基本途径。铁-碳微生物电解池中参与乙酸脱羧过程的乙酸激酶（ackA）和乙酰辅酶A 合成酶（acs）的基因丰度高于对照组，Fe 的存在能够提高乙酸激酶（ackA）的活性，乙酰辅酶A 合成酶通常和脱氢酶以[ACS/CODH]的形式存在，其中含有[4Fe-4S]簇和Ni-Ni-[4Fe-4S]位点，说明铁-碳微生电解池强化了乙酸产甲烷的过程。此外，氢营养型产甲烷菌参与了完整的CO还原途径的所有通路。涉及这些通路的重要酶包括：次甲基甲酰四氢甲烷蝶呤环化水解酶（mch）、亚甲基四氢甲烷蝶呤脱氢酶（mtd）以及5,10-亚甲基四氢甲烷蝶呤还原酶（mer）等。铁-碳微生物电解池中相关编码的基因丰度均高于对照组，说明该系统的CO还原为CH的产甲烷途径很活跃。同时铁-碳微生物电解池对于利用甲醇、甲酸等甲基类化合物的产甲烷过程中酶的合成也起到了一定的强化作用。因此，通过铁-碳微生物电解池可以提高酶基因的表达和酶活性，从而促进乙酸脱羧和二氧化碳还原，最终有利于甲烷的产生。