可视化高通量检测天冬氨酸转氨甲酰酶活性的方法

高博，冯旭东，李春，2

（1 北京理工大学化学与化工学院，北京 100081；2 清华大学化学工程系，北京 100084）

天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase，EC 2.1.3.2）催化L-天冬氨酸（L-Asp）和氨甲酰磷酸（CP）合成-氨甲酰基-L-天冬氨酸（-CP-L-Asp），是嘧啶生物合成途径的第一个酶。大肠杆菌来源的ATCase 是其中研究最多的酶，该酶是十二聚体，由两个三聚体催化亚基（c）和三个二聚体调节亚基（r）组成。每个催化亚基存在两个底物的结合域：Asp 结构域和CP 结构域。当L-Asp 和CP 与酶的催化亚基结合时，酶发生变构并使两个结构域之间距离缩短，进而引发L-Asp 的氨基对CP 的羰基碳进攻，发生转氨甲酰化反应。此外，ATCase的活性还受到嘌呤和嘧啶代谢途径产物的影响，三磷酸胞苷（CTP）和三磷酸腺苷（ATP）可以在ATCase 调节亚基的不同位点结合，并分别显著抑制和促进酶活。ATCase 的这一反馈调节机制具有重要的生理功能，它在生物体内控制嘌呤和嘧啶合成途径的代谢平衡，在生命活动中具有重要意义。

体外活性检测可以直观研究ATCase 反馈调节机制的影响。目前，检测ATCase 活性最普遍的方法是Kantrowitz 等提出的分光光度计法，该方法中使用了两个显色试剂，即2,3-丁二酮肟和安替比林，将它们分别溶于酸溶液中并混合。将显色剂加入反应后的溶液，在黑暗条件下室温静置16h，再在45℃水浴中加热并均匀光照30min，最后测定466nm 处的吸光度。尽管该方法与早期的pH 检测法和同位素示踪法相比，已经很大程度地简化了操作要求并提高了检测范围，但仍然需要过夜反应，且需要通过水浴和均匀光照来稳定显色产物的吸光度，因此无法满足高通量检测的需求。曹飞等研究表明，对二甲氨基苯甲醛（PDAB）可以在酸性溶液中与-CP-L-Asp 发生反应，产生黄色物质，并且在438nm处的吸光度与-CP-L-Asp的浓度呈现线性关系。因此，本研究使用PDAB 建立快速、简单和可视化的测定ATCase 活性的比色法，通过观察加入PDAB 显色剂后不同浓度的-氨甲酰基-DL-天冬氨酸（-CP-DL-Asp）的颜色变化，并测定吸光度，确定该检测方法的可行性；通过精密度实验和加标回收实验验证该方法的精确度；通过检测粗酶液和纯酶液反应，验证该方法检测ATCase 活性的准确度；通过酶标仪实验，确定该检测方法可以用于ATCase 的高通量检测。本研究为ATCase 的酶学研究和分子改造提供了更加方便、高效的检测方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种、质粒和培养基

大肠杆菌DH5，BL21（DE3）以及DH5-pET28a 均为本实验室保存。原核表达质粒pET28a 通过天根生化科技公司的质粒提取试剂盒获得。LB 培养基：酵母膏5g，氯化钠10g，蛋白胨10g，蒸馏水1000mL。

1.1.2 试剂、仪器及软件

-氨甲酰基-DL-天冬氨酸（-CP-DL-Asp，纯度95%）、L-天冬氨酸（纯度98%），上海毕得医药；氨甲酰磷酸二钠盐（纯度80%，在冷的50%乙醇中重结晶纯化）、PDAB （纯度98%），Sigma-Aldrich；2×mix 聚合酶，聚合美公司；2×fastmix 聚 合 酶，Trans 2K、Trans 2K Plus DNA marker，全式金公司；质粒提取试剂盒，天根生化科技公司；胶回收试剂盒，Protein Ladder 26614，Thermofisher 公司；Gibson assembly master mix由实验室自制。

PCR 仪，型号GE-TOUCH，杭州柏恒公司；电泳仪， 型号DYY-7C， 北京六一公司；Nanodrop，型号Nano-500，杭州奥盛公司；台式摇床，型号ZQZY-CS9，知楚仪器公司；高速冷冻离心机，型号J6-XP，贝克曼公司；高压破碎仪，型号JN-3000，广州聚能纳米公司；AKTA 蛋白纯化仪（型号AKTA purifer）和His Trap FF 预装柱，GE Healthcare； 酶 标 仪， 型 号infinite M200，TECAN 公司。引物设计和序列比对使用SnapGene软件。

1.2 实验方法

1.2.1 目的基因的扩增与重组质粒的构建

在NCBI 数据库中检索大肠杆菌K12 MG1655中表达ATCase 的基因B 和I（在基因组中相邻），将这两个基因的序列在SnapGene中组合，并在其上下游设计引物P1、P2。在大肠杆菌DH5（大肠杆菌K12 系菌株）中扩增出BI 基因。同时，设计引物P3、P4，通过PCR 将pET28a 线性化。线性化的基因片段通过琼脂糖凝胶电泳验证，并通过胶回收试剂盒回收。通过Gibson 组装方法，将两个片段构建成含有Kan抗性标记的重组质粒。

用于扩增目的片段的引物序列如下：P1,5'-CTTGCGGCCGCACTCGAATGGCTAATCCGCTATAT CAG-3'；P2,5'-GTGGTGGTGGTGGTGGTGATTGGC CAGCACCAC-3'；P3,5'-CATAATGTGGTGCTGGCC AATCACCACCACCACCACCACTG-3'；P4,5'-GATA TAGCGGATTAGCCATTCGAGTGCGGCCGCAAG-3'。

PCR 体系：Nuclease-Free Water，22μL；2×fastmix，25μL；引物（10μmol/L），1μL；模板（质粒或菌液），1μL。PCR 条件：预变性，95℃，2min；变性，95℃，20s；退火，60℃，20s；延伸，72℃，2kb/min；完全延伸，72℃，8min。共30个循环，最后存放于4℃冰箱。

1.2.2 重组质粒的大肠杆菌转化

将重组质粒pET28a-ATCase 转化至DH5中。在100μL DH5感 受 态 中 加 入10μL Gibson 组装的质粒，冰上孵育30min，42℃热击60s，冰上孵育5min，加入600μL LB 液体培养基，37℃、200r/min 摇床中复苏1h。菌液在5000r/min离心3min，并全部涂布于含有卡那霉素的LB 平板上，放于37℃培养箱中过夜。挑取单克隆，使用T7 引物进行菌落PCR 鉴定，将阳性克隆挑入含有卡那霉素的LB 液体培养基。使用天根生化科技公司的质粒提取试剂盒提取出重组质粒，并送金唯智公司测序。将测序正确的质粒转化到BL21（DE3）感受态中，用于表达目的蛋白。

1.2.3 目标蛋白的诱导表达和纯化

将转入重组质粒的BL21（DE3）菌液接种于400mL 含有卡那霉素的LB 液体培养基中，37℃、200r/min 培 养 至OD=0.6 左 右，加 入0.1mmol/L 的IPTG，16℃诱导20h。使用高速冷冻离心机收集菌体，用20mL 的50mmol/L 的Tris-HCl（pH8.0）缓冲液重悬，高压破碎，取上清液，在AKTA 蛋白纯化仪中用含0.5mol/L 咪唑的缓冲液洗脱，获得纯酶，并通过SDS-PAGE 验证。通过ATCase 的 吸 光 系 数，=0.59cm²/mg 计 算 纯 酶浓度。

1.2.4 ATCase活性的测定

酶活反应体系如下：5mmol/L 的L-Asp，5mmol/L 的CP，ATCase 纯酶液（浓度为6nmol/L），加入缓冲液补足至0.5mL，与25℃水浴中反应30min。反应结束后加入0.5mL 的10% PDAB 显色液（溶于2.4mol/L HCl 溶液中），避光静置15min。使用Nanodrop 检测438nm 的吸光度。定义每分钟催化生成1μmol-CP-L-Asp 为1 个酶活力单位（U），酶的比活力为酶活力除以蛋白质的质量。

粗酶酶活验证：在反应体系中，分别加入10μL、20μL、30μL、50μL ATCase 粗酶液替代纯酶液，其他条件不变。由于BL21（DE3）自身也表达ATCase，因此构建了含有pET28a 质粒的菌株作为对照。

高通量检测：配置0～5mmol/L 的-CP-DLAsp 溶液和纯酶反应体系各0.5mL，加入显色液反应后用酶标仪检测吸光度。

2 结果与讨论

2.1 重组质粒的构建与鉴定

将pET28a线性化片段和扩增得到的BI片段进行Gibson组装，将组装产物转入DH5中，挑单菌落，使用T7 引物进行菌落PCR 验证，结果如图1。

图1 重组质粒的菌落PCR验证

T7 引物是pET28a 上的特异性引物，因此菌落PCR 验证结果表明，目的基因已经被构建到载体上。将阳性菌落挑入液体培养基，通过质粒提取试剂盒提取质粒并送金唯智公司测序和比对，确认目的基因被成功构建到载体上，重组质粒命名为pET28a-ATCase。

2.2 ATCase的诱导表达和纯化

将转入重组质粒的BL21（DE3）菌株接种于液体培养基中，在对数生长阶段加入IPTG，16℃下过夜诱导，收集菌体并用高压破碎仪破碎。在AKTA 蛋白纯化仪中，将含有ATCase 的上清液用His Trap FF预装柱吸附，分别用含有0.5mol/L和1mol/L咪唑的Tris-HCl缓冲液洗脱，结果如图2。

图2 ATCase的SDS-PAGE验证

ATCase 是十二聚体，因此重组蛋白含有12 个His标签，与His Trap FF预装柱的结合能力强，需要使用较高浓度的咪唑洗脱。SDS-PAGE的结果显示，两个梯度的洗脱液中均含有ATCase 的催化亚基（34kDa）和调节亚基（17kDa），表明蛋白的纯化成功。使用100kDa 的超滤浓缩管浓缩洗脱液，除去咪唑并将缓冲液替换为含有20%甘油的缓冲液，通过Nanodrop测定A280计算酶的浓度，-80℃低温保存酶液。

2.3 绘制标准曲线

在Tris-HCl 缓冲液中，加入-CP-DL-Asp，配置浓度为1～5mmol/L 的梯度溶液，按照体积比1∶1 加入10%PDAB 显色液，室温静置15min。通过Nanodrop 测定438nm 的吸光度。将Tris-HCl 缓冲液作为对照，显色反应及标准曲线如图3所示。

图3 N-氨甲酰基-DL-天冬氨酸的标准曲线

由图3 可以看出，随着-CP-DL-Asp 浓度的升高，显色反应后的溶液呈更深的黄色，表明在该浓度范围内，可以通过观察颜色变化判断-CPDL-Asp 的含量。通过紫外测定，得到的线性方程为=0.3467-0.0022，=0.9998，线性关系良好。为确定PDAB显色法的检测下限，通过梯度稀释配置了浓度为0.5mmol/L、0.1mmol/L、0.05mmol/L、0.01mmol/L 的-CP-DL-Asp 溶液并进行检测。在浓度为0.1mmol/L时，平均吸光度为0.036，与标准曲线的误差较小，而当浓度为0.05mmol/L时，平均吸光度为0.025，与标准曲线的误差较大，推测在此浓度下仪器的测量误差对吸光度影响比较明显。因此，PDAB显色法的检测范围为0.1～5mmol/L。根据文献，ATCase 对CP 的饱和浓度为4.8mmol/L，因此PDAB显色法可以满足ATCase酶活测定的要求。

2.4 精密度实验

为保证显色反应的可重复性，配置浓度为2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L 的-CP-DL-Asp 溶液各6组，加入显色剂反应后测定吸光度。每个样品测定3次吸光度，取平均值。将6组样品测定结果取平均值，实验结果如表1。

表1 精密度测定结果

由表1 可得，PDAB 显色反应的精密度RSD 为0.87%～1.52%，表明检测结果精确度高。

2.5 加标回收率的测定

选择-CP-DL-Asp 浓度为1mmol/L 的溶液，加入-CP-DL-Asp 标准品使溶液浓度分别提高至2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L。加入显色剂反应，测定吸光度，并根据图3 中的标准曲线计算回收率，实验结果如表2。

表2 加标回收率的测定

由表2 可得，在检测范围内进行加标回收时，PDAB 显色法具有良好的回收率，结果为96.6%～101.9%，准确度较高。

2.6 使用PDAB显色法测定ATCase的活性

根据1.2.4 节的方法进行ATCase 活性的测定，为证明该显色法测定ATCase 活性的高效性，首先使用粗酶液进行显色反应，实验结果如图4 和表3所示。

图4 粗酶液显色反应

表3 粗酶液显色反应的紫外吸收

图4 表明，PDAB 显色法可用于定性检测ATCase 粗酶液的酶活。对照组显色结果表明，PDAB酸性显色液与大肠杆菌裂解液中的某些物质也会发生显色反应，颜色呈淡粉红色，同时还会与其他某些物质反应，产生沉淀。当加入粗酶液的体积大于20μL 时，能观察到显色液有浑浊。当加入含有ATCase 的粗酶液时，除了-CP-L-Asp 发生反应呈黄色以外，上述两个反应也会同时发生，随着加入粗酶液体积的增加，出现的沉淀明显增多，但是-CP-L-Asp和粉红色的显色反应没有明显增加，表明粗酶液与PDAB显色液发生沉淀的反应更优先。再根据表3 发现，粗酶液体积的增加对438nm的吸光度几乎没有影响，这表明沉淀的出现影响了PDAB 与-CP-L-Asp 的显色。当加入粗酶液体积为小于10μL 时，能更好地观察到显色反应的发生。粗酶液显色反应的结果表明，PDAB显色法可以用于高通量定性检测ATCase 的活性且不需要复杂耗时的蛋白纯化操作。

进一步使用PDAB 显色法测定ATCase 纯酶的比活性。根据1.2.4节的方法进行ATCase 纯酶活性的测定。定义每分钟催化生成1μmol-CP-L-Asp为1个酶活力单位（U），酶的比活力为酶活力除以蛋白质的质量，测定结果如表4。

表4 PDAB显色法测定ATCase纯酶的比酶活

由表4，通过PDAB 显色法测定三个平行反应的比酶活并取平均值，得到ATCase 的比酶活为56.83U/mg，RSD为2.60%，表明该检测方法准确。

2.7 使用酶标仪高通量测定ATCase的活性

为表明PDAB显色法可用于高通量测定ATCase的活性，使用酶标仪检测2.6 节中同一批纯酶液反应的样品，并与Nanodrop 的结果进行比对。配置0～5mmol/L 的-CP-DL-Asp 溶液，并根据1.2.4 节的方法，将每个样品取三组平行测定。酶标仪检测结果如表5、表6。

根据表5的结果，拟合酶标仪测定的标准曲线方程为=0.0989+0.0555，=0.9931，线性关系较好。由表6 得到ATCase 的比酶活为57.61U/mg，RSD为4.91%，结果与分光光度计误差很小，表明该方法可重复性较高。

表5 酶标仪测定的N-CP-DL-Asp的吸光度

表6 酶标仪测定ATCase纯酶的比酶活

表7列出本文构建的PDAB检测法与Kantrowitz等的传统方法的对比。

表7 两种检测方法的对比

尽管与传统检测方法相比，本文建立的PDAB检测法的灵敏度有所下降，但由于ATCase 可以在30min 内生成浓度高达约3mmol/L 的产物，因此灵敏度对该方法的适用性没有显著影响。此外，PDAB检测法在保持高精确度的同时，大幅缩短反应时间并明显简化操作步骤，从而大幅提高测定效率，适用于高通量检测ATCase的活性。

3 结论

本研究基于PDAB与-氨甲酰基-天冬氨酸反应生成黄色物质的性质，建立了高效检测ATCase活性的比色法。实验结果表明，在0.1～5mmol/L 的浓度范围内，PDAB 对-氨甲酰基-DL-天冬氨酸显色后，在438nm 的吸光度具有良好的线性关系，且精确度高，加标回收准确度高。将该显色法用于测定ATCase 的活性时，可以通过颜色的变化可视化地判断反应进行的程度。对于粗酶液，该显色法可以定性检测酶促反应是否发生，对于纯酶液，该方法可用于定量检测。通过分光光度计比色法测定ATCase 的比酶活，三组平行实验证明该方法的可重复性高。与传统方法相比，该检测法还具有耗时短、操作简单等优点，可以满足高通量筛选ATCase的需求。