不同品种红肉柚类胡萝卜素组分及其抗氧化能力研究

罗怿，李金强，李文云，王小柯，解璞

（贵州省农业科学院果树科学研究所，贵州 贵阳 550006）

柑橘果实品质分为外观品质和内在品质，外观品质包括大小、形状、色泽等。内在品质主要指糖酸含量、出汁率、可溶性固形物含量等。类胡萝卜素的种类与含量不仅决定柑橘果实的外观品质，也影响其营养品质和保健功能[1-2]。柑橘果实中含有丰富的类胡萝卜素，因其在400 nm～500 nm内有强光吸收能力，使果实呈红色、橙色和黄色等色泽[3]。类胡萝卜素由于含有较多的共轭双键，具有抗氧化、降低癌症发病率和抗慢性疾病等功效[4]。

柑橘类果实主要呈色色素为类胡萝卜素和花青素[5]，其类胡萝卜素种类约190种[6]，在果实中主要积累叶黄素，包括玉米黄素，β-隐黄质等种类[7]。果皮是类胡萝卜素积累的主要部位，通常果皮比果肉类胡萝卜素含量高2.5倍～15倍[8]。研究显示，不同种类柑橘果实成熟时类胡萝卜素呈现偏好性积累，不论果皮还是果肉中类胡萝卜素含量均是橘类最高，柑类高于杂柑类，柚类最低的规律[9-10]。类胡萝卜素在柚果实成熟时呈现出不同的颜色，果肉颜色从琯溪蜜柚的白色到葡萄柚的紫红色，颜色的差异除了与类胡萝卜素含量的不同有关[11]，还与各种类胡萝卜素占比不同有关，已证实番茄红素是呈红色的主要色素，β-胡萝卜素、玉米黄质和叶黄素是呈黄色的主要色素[12]。在目前已知的柚种质资源中，除了紫皮柚的果皮检测出花青苷，大多数柚类都是依靠类胡萝卜素呈色[13]。红肉“琯溪蜜柚”的外果皮、海绵层及果肉因番茄红素含量高[14]而显红色，“红绵蜜柚”和“三红蜜柚”果实中的呈色色素主要为番茄红素与β-胡萝卜素[15]，而黄肉“黄金蜜柚”果肉呈色成分主要为β-胡萝卜素[16]。目前，柑橘主要类胡萝卜素相关的研究主要集中于甜橙和宽皮柑橘等品种，对柚类果实中类胡萝卜素的积累特征和机制还需进一步研究。

贵州地方柚资源丰富，已有研究发现“红香柚”、“利王柚”和“印江红橙”等红肉品种，均具有果形较小、脆嫩化渣、高抗病性等优点[17]，其成熟果肉呈红色、粉红色和橙色等颜色，海绵层呈深浅不同粉红色，但并未明确其中的主要色素。为确定石阡红橙、德江红橙、红香柚、印江红橙、利王柚以及思南红橙6个品种的果肉所含类胡萝卜素主要种类和含量，本研究运用液相色谱串联质谱对果肉中的类胡萝卜素种类和含量进行定性定量分析，探究其显色特征，同时对总酚和总类黄酮等活性成分[18]进行测定，结合铁离子还原/抗氧化能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）抗氧化能力、羟基自由基清除能力3种体外抗氧化能力测定方法，对果肉的活性成分及抗氧化能力进行综合比较分析，以期为贵州地方柚资源的果实品质评价和利用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

柚果肉样品：供试柚果肉共6份，分别为石阡红橙、德江红橙、红香柚、印江红橙、思南红橙和利王柚。采自贵州省6个乡镇，均于成熟期采摘。

甲醇、乙腈、乙醇、丙酮、甲基叔丁基醚、二丁基羟基甲苯（butylated hydroxy toluene，BHT）抗氧化剂（均为色谱纯）：德国Merck公司；标准品α-胡萝卜素、花药黄质、番茄红素、玉米黄质、紫黄质、γ-胡萝卜素、新黄质、β-胡萝卜素、叶黄素、β-隐黄质、虾青素、β-阿朴胡萝卜素醛、六氢番茄红素、辣椒红素、八氢番茄红素、ε-胡萝卜素、橙皮苷（均为色谱纯）：美国Sigma-Aldrich公司；没食子酸、福林酚试剂、碳酸钠、氢氧化钠、柠檬酸、二甘醇（均为分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；总抗氧化能力试剂盒：江苏科铭生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

MM 400研磨仪：弗尔德（上海）仪器设备有限公司；SHIMADZU CBM 30A超高效液相色谱：日本岛津公司；6500 Quadrupole Trap质谱仪：美国应用生物系统公司；ML204型万分之一天平：瑞士梅特勒托利多公司；SpectraMax 190全波长酶标仪：美国Molecular Devices公司；T6新世纪紫外可见分光光度计：华威科创（武汉）科技有限公司；DW-HL538超低温冰箱：中科美菱低温科技股份有限公司；KQ5200DE超声清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 果肉样品处理方法

在柚果实成熟期进行取样，每个品种选取3棵树，每棵树各取3个整果，果肉分离混合后液氮冷冻，保存于-80℃超低温冰箱。

1.3.2 液相色谱串联质谱测定果肉类胡萝卜素含量

1.3.2.1 果肉类胡萝卜素的提取

取出超低温保存的冻干果肉，研磨至粉末状。配制正己烷∶丙酮∶乙醇体积比为2∶1∶1的提取液，在提取液中加入体积分数为0.01% BHT。称取100 mg的果肉粉末，加1 mL的提取液（含体积分数为0.01% BHT）。涡旋30s后，室温23℃下超声20min。4℃、12 000 r/min离心5 min，吸取上清液。重复以上步骤进行两次提取，合并两次上清液，液氮吹干。用200 μL（乙腈∶甲醇=3∶1，体积比）混合液 ∶甲基叔丁基醚=85∶15（体积比）复溶样品，涡旋30 s，使目标物质充分溶解，超声2 min，4℃、12 000 r/min离心2 min。过0.22 μm滤膜，后保存于棕色进样瓶中，采用液相色谱串联质谱法分析。果肉类胡萝卜素提取试验全程需避光处理。

1.3.2.2 标准溶液配制

分别准确称取16种类胡萝卜素标准品1 mg溶于10 mL甲醇和甲基叔丁基醚体积比为1∶1的混合溶液中，配制成0.1 mg/mL的初始浓度，分别稀释为不同的浓度梯度，以色谱的峰面积对进样浓度做线性回归分析，分别建立16种类胡萝卜素单体标准品的标准曲线。16种类胡萝卜素单体标准品对应的线性方程如表1所示。

表1 类胡萝卜素单体标准品线性方程Table 1 Linear equation of carotenoid pure standards

1.3.2.3 色谱质谱条件

色谱柱：YMC C30 柱（2 mm×100 mm，3 μm）；流速：0.8 mL/min；柱温：28 ℃；进样量：5 μL。

流动相A：乙腈和甲醇体积比3∶1（含体积分数为0.01%BHT）；流动相B：甲基叔丁基醚（含体积分数为0.01%BHT）；洗针液为甲醇；线性梯度洗脱程序：0 min，A ∶B=85 ∶15（体积比）；2 min，A ∶B=75 ∶25（体积比）；2.5 min，A ∶B=40 ∶60（体积比）；3 min～4 min，A ∶B=5 ∶95（体积比）；4 min，A ∶B=85 ∶15（体积比）；6 min，A∶B=85∶15（体积比）；大气压化学离子源温度350℃，帘气172 368.925 Pa；在6500 Quadrupole Trap质谱仪中，每个离子对是根据优化的去簇电压和碰撞能进行扫描检测。

1.3.3 果肉总多酚提取与测定

1.3.3.1 一水合没食子酸标准曲线的制作

称取0.110 0 g一水合没食子酸，用蒸馏水溶解、定容至100 mL，此溶液质量浓度为1 000 mg/L；分别吸取此溶液 0、1、2、3、4、5 mL 于 100 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，所得一水合没食子酸标准溶液的质量浓度分别为 0、10、20、30、40、50 mg/L。测定 765 nm吸光度，以765 nm下的吸光度为纵坐标，一水合没食子酸标准溶液的质量浓度为横坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y=8.471 4X＋0.036 1，R2=0.994 1。

1.3.3.2 总多酚含量的测定

采用福林酚比色法测定植物样品中总多酚含量[19]。取出超低温保存的果肉，研磨至粉末状，称取0.300 0 g，用20 mL蒸馏水洗入25 mL容量瓶中，至100℃沸水浴中保温30 min取出、冷却、定容、过滤，滤液备用。吸取4 mL～6 mL滤液（加一水合没食子酸标准溶液1 mL），分别加入福林酚试剂1 mL及3 mL 7.5%碳酸钠溶液，用蒸馏水定容至25mL，混匀，室温（22℃）下显色30min～60 min，测定765 nm吸光度，根据稀释倍数和标准曲线，计算果肉总多酚含量，公式如下。

式中：C为标准曲线上查得多酚含量，μg；N为稀释倍数；Vt为提取液总体积，mL；Vs为测定取液量，mL；m 为样品质量，g。

1.3.4 果肉总类黄酮提取与测定

参考NY/T2010—011《柑桔类水果及制品中总黄酮含量的测定》测定[20]。

1.3.5 体外抗氧化能力测定

参照总抗氧化能力试剂盒说明书方法测定FRAP、DPPH抗氧化能力和羟自由基清除能力。

1.4 数据分析

用软件SPSS 21.0对所有数据进行差异显著分析及相关性分析，用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据。

2 结果与分析

2.1 不同品种柚成熟果肉颜色

不同品种柚成熟果肉颜色见图1。

图1 不同品种柚成熟果肉颜色Fig.1 Mature fruit flesh color of different pomelo varieties

不同品种柚成熟果实果肉颜色则存在一定差异，参照NY/T2435—2013《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南（柑橘）》[21]，观测到思南红橙为黄色，利王柚为橙红色，石阡红橙为浅粉红色，德江红橙为粉红色，红香柚和印江红橙为红色。6个品种果实海绵层均表现淡粉红色。

2.2 不同品种柚类胡萝卜素组分与含量差异

6份供试柚果肉类胡萝卜素组分与含量情况见表2。

表2 不同品种柚果肉类胡萝卜素含量Table 2 Content of carotenoids in different pomelo fresh mg/kg

由表2可知，检测到柚成熟果肉中含有花药黄质、玉米黄质、紫黄质、γ-胡萝卜素、新黄质、β-胡萝卜素、叶黄素、β-阿朴胡萝卜素醛、番茄红素、辣椒红素10种类胡萝卜素。石阡红橙果肉类胡萝卜素组分含量大小依次为γ-胡萝卜素＞玉米黄质＞叶黄素＞番茄红素＞紫黄质＞β-阿朴胡萝卜素醛＞花药黄质＞辣椒红素＞新黄质＞β-胡萝卜素；德江红橙果肉类胡萝卜素组分含量大小依次为γ-胡萝卜素＞玉米黄质＞叶黄素＞番茄红素＞β-胡萝卜素＞β-阿朴胡萝卜素醛＞紫黄质＞花药黄质＞辣椒红素＞新黄质；红香柚果肉类胡萝卜素组分含量大小依次为γ-胡萝卜素＞玉米黄质＞番茄红素＞叶黄素＞β-胡萝卜素＞β-阿朴胡萝卜素醛＞紫黄质＞花药黄质＞辣椒红素＞新黄质；印江红橙果肉类胡萝卜素组分含量大小依次为γ-胡萝卜素＞玉米黄质＞叶黄素＞番茄红素＞β-胡萝卜素＞β-阿朴胡萝卜素醛＞紫黄质＞花药黄质＞辣椒红素＞新黄质；思南红橙果肉类胡萝卜素组分含量大小依次为γ-胡萝卜素＞玉米黄质＞叶黄素＞β-胡萝卜素＞番茄红素＞β-阿朴胡萝卜素醛＞紫黄质＞花药黄质＞辣椒红素＞新黄质；利王柚果肉类胡萝卜素组分含量大小依次为γ-胡萝卜素＞玉米黄质＞叶黄素＞番茄红素＞β-胡萝卜素＞β-阿朴胡萝卜素醛＞紫黄质＞花药黄质＞辣椒红素＞新黄质。6个品种中含量最高的组分均是γ-胡萝卜素，在10种类胡萝卜素组分含量总和中占比均大于50%，是主要的呈色色素。石阡红橙含量最少的类胡萝卜素组分是β-胡萝卜素，而其他5个品种含量最少的类胡萝卜素组分是新黄质。

2.3 不同品种柚总类胡萝卜素、总多酚及总类黄酮含量

不同品种柚果肉总类胡萝卜素、总多酚及总类黄酮含量结果见表3。

表3 不同品种柚类总胡萝卜素、总多酚和总类黄酮含量Table 3 Content of total carotenoids，total polyphenols and total flavonoids in different pomelo varieties

由表3可知，不同品种柚果肉总类胡萝卜素、总多酚及总类黄酮含量不同。其中印江红橙的总类黄酮含量最高，为482.22 mg/kg，其次为利王柚、红香柚、德江红橙、石阡红橙和思南红橙。总类胡萝卜素含量介于150.81 mg/kg～241.29 mg/kg，大小排序为思南红橙＞印江红橙＞石阡红橙＞德江红橙＞利王柚＞红香柚。总多酚含量大小排序为红香柚＞德江红橙＞印江红橙＞利王柚＞石阡红橙＞思南红橙。

2.4 柚果肉抗氧化能力比较

不同品种柚果肉抗氧化能力大小参见表4。

表4 不同品种柚抗氧化能力比较Table 4 Comparison of antioxidant ability in pomelo different varieties

由表4可知，品种不同，果肉中的抗氧化能力有较明显差异。6个品种柚果肉的FRAP抗氧化能力介于2.65 μmol Trolox/g～4.27 μmol Trolox/g，其中最强的是利王柚，其次分别是德江红橙、红香柚、思南红橙、石阡红橙、印江红橙。DPPH抗氧化能力在1.91 μmolTrolox/g～3.25 μmol Trolox/g之间，大小排序为利王柚＞德江红橙＞石阡红橙＞红香柚＞印江红橙＞思南红橙。羟基自由基清除率最高为利王柚，其次是红香柚、德江红橙、印江红橙、思南红橙、石阡红橙，石阡红橙自由基清除率最低。3种不同方法测定抗氧化能力结果较一致。

由于测定方法原理不同导致抗氧化能力结果有差异，为综合评价各品种柚果肉的抗氧化能力，采用综合抗氧化能力评价指数（antioxidant potency composite，APC）[22]来进行评定。

不同品种果肉的APC指数参见表5，6个品种果肉的APC指数介于74.91%～100.00%，利王柚最高，其次是德江红橙、红香柚、石阡红橙、印江红橙和思南红橙。

表5 综合抗氧化能力指数评价Table 5 Evaluation of antioxidant potency composite

2.5 抗氧化能力与总类胡萝卜素、总多酚和总类黄酮的相关性

抗氧化能力与总类胡萝卜素、总多酚和总类黄酮的相关性分析结果见表6。

表6 柚果肉抗氧化能力与总类胡萝卜素、总多酚和总类黄酮的相关性分析Table 6 Corrrelation analysis between the total antioxidant capacity and the contents of total carotenoids，total phenolic and flavonoid in pomelo

FRAP、DPPH和羟基自由基清除能力3种方法之间呈正相关，FRAP和DPPH在p<0.01极显著水平正相关，相关系数r达0.853，FRAP和羟基自由基清除率在p<0.05显著水平正相关，表明这3种抗氧化活性能力评价方法比较可靠。总类胡萝卜素含量和总多酚含量（r=0.882，p<0.01）具有极显著正相关性，总类黄酮含量（r=0.447，p<0.05）具有显著正相关性。总多酚含量、总类黄酮含量分别和FRAP值，DPPH值和羟自由基清除率为正相关，而总类胡萝卜素与PRAP值为负相关，这可能与果肉中所含花青素有关。

3 结论

对6个品种柚果肉中的类胡萝卜素种类进行定性定量分析，检测到果肉中含有花药黄质、玉米黄质、紫黄质、γ-胡萝卜素、新黄质、β-胡萝卜素、叶黄素、β-阿朴胡萝卜素醛、番茄红素、辣椒红素10种类胡萝卜素。6个品种中含量最高的组分均是γ-胡萝卜素，在10种类胡萝卜素组分含量总和中占比均大于50%，是主要的呈色色素。石阡红橙含量最少的类胡萝卜素组分是β-胡萝卜素，而其他5个品种含量最少的类胡萝卜素组分是新黄质。不同品种果肉中类胡萝卜素含量和组分占比不同，导致其果肉颜色不同。检测结果显示，γ-胡萝卜素、玉米黄质和叶黄素含量较高的思南红橙，其果肉呈现黄色；红香柚和印江红橙番茄红素较高，果肉呈现红色。果肉抗氧化活性成分中，总类黄酮含量在55.54 mg/kg～482.22 mg/kg之间；总类胡萝卜素含量在150.81 mg/kg～241.29 mg/kg之间；总多酚含量在0.41 mg/g～0.77 mg/g之间。FRAP、DPPH和羟基自由基清除能力等3种体外抗氧化方法对果肉的活性成分及抗氧化能力进行综合比较分析，综合抗氧化能力大小排序为利王柚＞德江红橙＞红香柚＞石阡红橙＞印江红橙＞思南红橙。FRAP和DPPH抗氧化方法作用机制相同，因而两者之间在p＜0.01水平相关性表现极显著。除FRAP和总类胡萝卜素呈负相关外，FRAP与总多酚和总类黄酮含量呈正相关性，DPPH和羟基自由基清除能力与总类胡萝卜素、总多酚和总类黄酮含量呈正相关性。本研究明确了6种贵州地方红肉柚果实的类胡萝卜素的组分，也为其果实品质的评价提供了科学依据，有助于地方优良品种的开发利用。