基于揉混处理和扩散波谱分析的大豆分离蛋白流变特性研究

栾滨羽， 马 爽， 潘伟春， 朱秀清， 张 波

(1.中国农业科学院 农产品加工研究所/农业农村部农产品加工综合性重点实验室, 北京 100193；2.哈尔滨商业大学 食品工程学院/黑龙江省谷物食品与谷物资源综合加工重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150028； 3.浙江工商大学 食品与生物工程学院， 浙江 杭州 310018)

大豆等植物蛋白原料，在挤压的机械能和热能作用下，可以形成具有类似肉类纤维状结构、质构、口感的仿肉制品[1]。在该过程中黏度不同导致的速度梯度曾被认为是纤维结构形成的原因[2-3]，即挤压时物料黏度影响蛋白质的拉伸，进一步影响纤维状结构的形成[4]。实际上，天然高分子蛋白质拉伸需要克服熵弹性，即首尾所受拉伸速度梯度(S)和分子链收缩的弛豫时间(τ)的乘积(S×τ)足够大，才可能被拉伸；而弛豫时间τ和体系黏度的二次方呈正比[5]。流变特性还与蛋白质的种类、成分和加工工艺有关[4,6-8]，因此物料黏度等流变特性对于调控植物蛋白仿肉制品纤维状结构的形成具有重要指导意义。

受限于植物蛋白浓体系(含水率为30%～60%)难以形成内部均一和外部规整的样品，常用的动态流变仪无法较好地表征其流变特性，也无从研究植物蛋白随加热温度、剪切方式等模拟挤压过程流变特性的变化[9-11]。受材料科学中采用双轴揉混仪在研究、表征聚合物材料松弛行为和内部结构的启发，拟采用双轴揉混来模拟挤压机内的加工条件，并在此条件下研究植物蛋白的流变特性[12-13]。不同于动态流变通过施加随时间做小幅度正弦变化的应力使样品产生可逆的小形变，双轴揉混通过剪切等作用使样品屈服产生不可逆的形变，属于大形变。扩散波谱可以利用激光光散射技术测量体系中示踪颗粒的布朗运动情况，并用该颗粒散射光的光强自相关函数表征样品黏弹性的流变测量方法，适用于高黏稠半固体、透光性差等体系的流变特性测量[14-15]。由于扩散波谱检测的是颗粒在测量体系中布朗运动轨迹，几乎不扰动测量体系或不造成测量体系的形变，故属于微形变或微流变检测方法。与传统动态流变相比，该方法既可表征较大剪切频率范围内较弱流变体系的弹性模量[16]，还可检测蛋白质热凝胶等含化学反应的体系[17]，同时也可满足在不复溶的前提下表征蛋白质样品流变特性的目的。双轴揉混仪和扩散波谱仪在合成高分子材料研究中应用较多，但在食品材料研究中鲜有报道[18]。

本实验采用双轴揉混仪和扩散波谱分别表征大豆分离蛋白在大形变和微形变下的流变特性变化。以大豆分离蛋白为实验原料，研究不同含水率和搅拌时间下大豆分离蛋白表观稠度的变化情况，以及制备的大豆分离蛋白的微流变特性，希望为理解高水分挤压过程蛋白质纤维状结构形成机制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

市售大豆分离蛋白，山东御馨生物科技有限公司，蛋白质量分数为92.68%± 0.11%，其中可溶性蛋白质量分数为71.82%。

1.2 仪器与设备

Plastograph EC plus型双轴揉混仪，德国Brabender公司；RheoLab型扩散波谱仪，瑞士LS公司。

1.3 实验方法

1.3.1大豆分离蛋白揉混实验

物料揉混采用的双轴揉混仪内部结构如图1。双轴揉混仪由一个可控温的“∞”型揉混腔和一对相向差速转动的转子(roller)组成。揉混腔混合室温度80 ℃，转子转速为63 r/min。揉混腔内物料含水率和搅拌时间如表1。

图1 揉混仪内部结构示意图Fig.1 Internal structure diagram of kneading instrument

表1 大豆分离蛋白揉混参数

1.3.2表观稠度测量

样品表观稠度由双轴揉混仪每2 s自动检测并记录。50 min后收集样品立刻真空包装，4 ℃过夜平衡后用于后续微流变特性测量。为更好地说明表观稠度相关指标含义，表观稠度随时间变化曲线如图2。测试指标为：表观稠度达到的最大值为ηp，对应的达到峰值的时间为tp，按照式(1)计算达到峰值10 min后稠度降低幅度η。

(1)

式(1)中，|Δη|为峰值稠度ηp与达到峰值稠度10 min后对应的稠度ηp+10之间差值的绝对值。

图2 表观稠度随时间的变化Fig.2 Apparent consistency changes with times

1.3.3微流变特性测量

揉混后的蛋白质体系的微流变特性采用扩散波谱仪检测[14,17]，使用光学长度为10 mm的比色皿作为容器。扩散波谱仪的光源是波长为685 nm(45 mW)的激光。样品温度由帕耳贴(peltier)温度控制器控制，由数字相关器根据通过光电倍增管的强度评估。使用扩散波谱仪自带的Micro Rheology Analysis v9.2.11软件分析多重散射后的光信号，按照式(2)计算获得自相关函数g1(τ)和均方位移(MSD)。自相关函数、均方位移可以提供样品体系松弛动力学特性。

(2)

通过比较参考样本的计数率(CR)直接计算出样本的l*，如式(3)。

(3)

式(3)中，lref是标准样品的光子传输平均自由程；下标sample代表样品，ref代表标准样品；CR为计数率，表示散射光的光强。

根据Generalized Stokes-Einstein关系式，利用七次多项式的Laplace变换[19]，可以从式(1)逆向计算[Δr2(ω)]。黏弹模量在从时域到频域的均方位移离散傅里叶变换后，可按式(4)估算。G′为储能模量，G″为损耗模量。所有实验均在30 ℃下进行。

(4)

式(4)中，G*(ω)为复数黏度，ω为频率；kB为Boltzmann常数；T表示温度；a为示踪剂的半径，i为单位虚数；[Δr2(ω)]是散射的均方位移。

1.3.4数据处理

每个样品设置两次平行实验，且两次重复重现性平均在10%以内。样品表观稠度测量结果采用Origin2019软件绘制，大豆分离蛋白揉混特性和不同制备条件下样品网格大小的影响表格用Excel软件绘制，结果用平均值±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 不同揉混处理条件对大豆分离蛋白流变特性的影响

复杂流体通常有不同结构层次和多种组分，当被剪切时，其形变与应力的关系可以反映其储能模量和损耗模量[20]，因此可通过黏度、扭矩、储能模量、损耗模量等参数表征。

2.1.1含水率对大豆分离蛋白揉混时表观稠度的影响

大豆分离蛋白在不同含水率下揉混的表观稠度曲线如图3。表观稠度间接表征揉混腔中以恒定转速搅拌样品时的阻力，表观稠度越大表明转子所受阻力越大。图3表明，水分加入后无法立刻与样品混匀，此时50%含水率样品的起始稠度更大，在5.8 min处最先达到峰值，14～31 min样品稠度在50～88 Pa·s间不断波动但整体呈下降趋势，31～50 min后样品稠度基本稳定在50 Pa·s，曲线整体变化幅度为65 Pa·s。

图3 50 min内不同含水率下揉混大豆分离蛋白 表观稠度变化Fig.3 Apparent consistency changes of soybean protein isolate kneaded under different moisture content in 50 min

在水分混匀过程中，65%含水率样品稠度的增长相对较缓，甚至在9.0～9.5 min内下降了22 Pa·s；在11.5 min升至峰值稠度88 Pa·s，随后逐渐下降；在26 min时稠度为62 Pa·s，在29～50 min内稠度保持在50～60 Pa·s间波动，曲线整体变化幅度为38 Pa·s。

80%含水率下曲线整体呈阶段性上升趋势，8～16 min、23～40 min、43～45 min、46～50 min内稠度依次维持在38、62、75、88 Pa·s，在45.8 min时才达到峰值。

对比3种含水率样品，50%含水率样品达到峰值10 min后下降幅度为31.30%，65%含水率样品为26.14%，80%含水率虽在最后5 min才达到在峰值但在搅拌过程中出现多次稠度稳定的情况。在相同搅拌时间内，样品含水率越大，稠度曲线下降幅度越小，越稳定。

2.1.2搅拌时间对大豆分离蛋白揉混时表观稠度的影响

“间歇搅50 min”指搅拌10 min-暂停30 min-再搅拌10 min图4 50 min内不同搅拌方式下揉混大豆分离 蛋白表观稠度变化Fig.4 Apparent consistency changes of soybean protein isolate kneaded with different mixing methods in 50 min

图4显示了不同搅拌时间对大豆分离蛋白揉混时表观稠度的影响。由图4可见，与相同含水率、持续搅拌50 min样品相比，间歇搅拌样品在初始10 min，表观稠度上升较慢；伴随着剪切停止表观稠度瞬间降至0；暂停30 min后再次搅拌时瞬间达到峰值稠度108 Pa·s，表明80 ℃下暂停搅拌的30 min内蛋白质变性后转子再次转动时所受阻力更大。此外，图4说明相同水分含量，间歇搅拌样品更加不稳定，达到峰值10 min后下降幅度为42.59%，表明剪切力对蛋白质聚集体形成起阻碍作用，其峰值稠度(108 Pa·s )较持续搅拌峰值稠度(88 Pa·s)高，表明80 ℃下暂停搅拌的30 min内蛋白质熔融变性可形成强度更大的交联网络。

聚合物的分子质量和结构与流变性变化密切相关，黏弹性则是聚合物流变学特性的主要体现。由于黏性行为的滞后性响应，外力去除时材料不会立刻运动产生滞后或松弛行为。该应力松弛行为常通过扭矩、应力、应变等参数随时间的变化曲线表征[21-22]。聚合物在揉混仪中的扭矩变化曲线通常有如下典型行为：物料加入揉混腔后，转子所受阻力迅速增加，扭矩急剧上升并瞬间达到加料峰值；当这一阻力被克服时，以固定速度旋转的转子所需的扭矩减小，在一定时间内达到稳定状态；随后随着分子剪切方向取向，扭矩会逐渐下降[23]。

本实验中，50%和65%含水率样品的表观稠度曲线在达到熔融峰值后同样具有松弛行为，水分在揉混过程中起润滑和增塑作用，含水率越低样品颗粒对转子转动的阻力越大，更快达到更大的扭矩峰值。这与Zhang等[24]在相同温度下50%、55%、60%含水率条件下挤压花生蛋白结果相似，低含水率熔体的黏度更大，混合所需的能量更多，单位机械能更大。达到峰值后，两者稠度达到稳定所需时间相近，但65%含水率所需时间稍长，这与蛋白质浓度和聚集体形成有关[21]。水分降低了起弹性作用的蛋白质聚合物比例，同时减弱了蛋白质分子之间的摩擦，致使剪切力作用于内层伸展状态的蛋白质后不会瞬间带动外层蛋白质发生纠缠或粘连[25]。80%含水率样品由于含水率较高，蛋白质可以形成较大的交联结构，故峰值扭矩和达到峰值的时间均较大。此外，多组分蛋白松弛行为并不是单一组分的简单加和[26]。如大豆分离蛋白中主要包括大豆球蛋白和β-大豆伴球蛋白，两者结构不同因此聚集行为也不一致[27-28]，故还需进一步研究蛋白质组分对大豆分离蛋白流变特性的影响。

2.2 不同揉混处理条件对大豆分离蛋白微流变特性的影响

相比于传统动态流变表征的样品受力后的宏观变化，微流变侧重于样品微观结构变化，通过检测颗粒在测量体系中布朗运动轨迹推导出测量体系受力后的宏观现象[20]。结果主要包括和颗粒布朗运动轨迹相关的散射光自相关函数、表征颗粒布朗运动轨迹的均方位移等随时间的变化[29-31]。

2.2.1不同含水率和搅拌方式对大豆分离蛋白微流变散射光光强自相关函数的影响

图5是4种不同揉混处理下大豆分离蛋白样品的散射光自相关函数的变化，散射光自相关函数衰减速度反应示踪粒子运动的快慢[30]。由图5可知，在扩散波谱测试过程中，所有散射光自相关函数的衰变时间都大于10-4s，根据Einstein-Stokes关系式[32]，这一现象表明体系可能含大颗粒和(或)体系内部的黏性非常大。水含量越低，光强自相关函数衰减的越快，这表明示踪粒子运动的越快，但水含量升高65%以后，所对应的自相关函数几乎没变化。搅拌方式对蛋白质交联程度有很大影响，和持续搅拌样品相比，搅拌10 min-暂停搅拌30 min-再搅拌10 min导致对应的函数衰减快，分析原因可能是持续搅拌有助于形成更多的交联，体系黏度较大。

“间歇搅50 min”指搅拌10 min-暂停30 min-再搅拌10 min；黑色实心正方形组成的线条代表含水率50%，持续搅拌50 min的样品；红色空心圆形组成的线条代表含水率65%，持续搅拌50 min的样品；粉色空心倒三角形组成的线条为含水率80%，持续搅拌50 min的样品；蓝色实心正三角形组成的线条为含水率65%,搅拌10 min-暂停30 min-再搅拌10 min的样品。图5 不同处理条件和方式所得到的大豆分离 蛋白的散射光自相关函数Fig.5 Scattered light autocorrelation function of soybean protein isolate with different treatment conditions and methods

2.2.2不同含水率和搅拌方式对大豆分离蛋白的微流变均方差位移和网格大小的影响

含水率对样品中示踪粒子运动的影响结果见图6。当样品含水率为50%时，在不同时刻，示踪粒子的均方差位移(mean square deviation，MSD)最大，表明在该条件下，示踪粒子运动的最快，其次是含水率80%，最慢的是65%含水率样品。两种搅拌方式下MSD的数量级差异较小，故搅拌方式对体系形成网格尺寸的影响较小[31]，这一结果和图5基本吻合。同时，除了含水率80%样品，其他条件下的示踪粒子运动时，其MSD～τα中的α都小于1，这表明体系的流体力学特性接近固体[31]。除了中途暂停搅拌样品，其他样品在衰变时间足够长时，出现一个不依赖于衰变时间的平台，其对应的均方差位移如图6虚线指示纵坐标值，该值的开平方可以反映样品网格结构的网格大小(cage size)[33-34]。不同处理条件对样品网格大小的影响结果见表3。由表3可知，不同处理的蛋白质的网格大小为5～55 nm(网格大小由MSD值的开平方表示，MSD的单位为μm2，开方后经换算，单位为nm)。网格变小，对示踪粒子的约束越来越明显，导致其所对应的光强自相关函数衰减变慢，和图5一致。这一结果和小麦面团制备过程中面筋蛋白网络对示踪粒子的约束相似[14]，即网格越小约束越大。

“间歇搅50 min”指搅拌10 min-暂停30 min-再搅拌10 min；虚线指示不依赖于衰变时间的平台值；黑色实心正方形组成的线条为含水率50%，持续搅拌50 min的样品；红色空心圆形组成的线条为含水率65%，持续搅拌50 min的样品；粉色空心倒三角形组成的线条为含水率80%，持续搅拌50 min的样品；蓝色实心正三角形组成的线条为含水率65%，拌10 min-暂停30 min-再搅拌10 min的样品。图6 不同处理条件和方式所得到的大豆分 离蛋白的均方差位移Fig.6 Mean square deviation shift of soybean protein isolate obtained by four different treatment conditions and methods

表3 不同处理条件和方式对样品中网格大小的影响

2.2.3不同含水率和搅拌方式对大豆分离蛋白的微流变黏弹模量变化的影响

通过扩散波谱测定光通过散射介质时遵循的光路分布情况可得到材料的储能模量G′和损耗模量G″，测定结果如图7。由图7可知，随应变频率增大，不同含水率和搅拌方式处理的4种样品的复数黏度(complex viscosity)逐渐下降，表明都存在剪切变稀行为。表3显示，含水率65%样品的网格较小，对应的复数黏度较大。含水率50%和80%样品的复数黏度几乎无差别，但比含水率65%样品低1～2个数量级。该结果表明，网格平均大小为5～7 nm时，体系中的颗粒较容易感知网格对它们的约束，复数黏度较高[31];反之，当网格较大(11～55 nm)时，如含水率为50%或80%，体系颗粒感知到网格对其的约束较小，复数黏度较小。在小麦面团中也可观察到类似的现象[14]。

黑色实心正方形组成的线条代表G′；红色空心圆形组成的线条为G″；蓝色空心三角形组成的线条为复数黏度。图7 大豆分离蛋白的制备条件对体系黏弹性能的影响Fig.7 Effect of preparation conditions of soybean protein isolate on viscoelastic properties of system

在所测的频率范围内，4种样品的储能模量均大于损耗模量，均呈现出凝胶态行为[4]。储能模量从小到大的样品排序为50%含水率-搅拌50 min、80%含水率-搅拌50 min、65%含水率-搅拌10 min-暂停30 min-再搅拌10 min、65%含水率-搅拌50 min；对应的储能模量为10-4～10-2Pa、10-3～10-2Pa、10-2～10-1Pa、10-1～1 Pa，和网格大小基本呈反比，即储能模量越小，网格越大。

本研究表明，在双轴揉混的4种加工条件中，较低含水率(50%)时，蛋白质形成了网格较大的结构，这可能是水分较少时，蛋白质通过物理团聚，故储能模量较低；65%含水率和80%含水率形成的网格大小接近，但65%含水率时蛋白质浓度较高，故其储能模量较高；持续搅拌50 min可以形成更为均匀的蛋白质连续相，故储能模量较间歇搅拌高。

3 结 论

50%～80%含水率、持续搅拌或间歇搅拌的双轴揉混实验显示，随着含水率从50%增加至80%，大豆分离蛋白表观稠度达到峰值所需时间越长。表观稠度达峰10 min后的下降幅度显示，持续搅拌所形成的蛋白质体系稠度下降幅度较小，较含水率50%或间歇搅拌所形成的体系稳定。含水率较低(50%)时，蛋白质倾向于形成网格较大，连续较差的结构，储能模量较低；增加含水率至65%～80%，或在较高含水率(65%)时持续搅拌，所形成的网格较小，储能模量较高。本研究表明，通过揉混处理，较高含水率的大豆分离蛋白形成了网格较小的网络结构，这可能是高水分挤压组织化蛋白的纤维状结构较低水分挤压蛋白明显的原因之一。本研究旨在探讨不同种类蛋白质或加工助剂诱导后蛋白质的流变特性，同时为理解蛋白质纤维状结构的形成提供可能的方法和理论参考。

致谢

衷心感谢中国科学院化学研究所贾迪研究员对本研究在流变特性分析方面的帮助。