淡水鱼中3 种吸虫囊蚴多重PCR 检测方法的建立

高俊峰，王 鑫，毛瑞锋，孙云异，王春仁，黄翠琴*

（1.龙岩学院生命科学学院/福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室/寄生虫研究室，福建 龙岩 364012；2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

鱼源性吸虫（Fishborne zoonotic trematodes，FBT）是食源性寄生虫的一类，主要通过鱼类传播，人和动物通过食入生的或未熟的含有吸虫囊蚴的鱼而感染，其中多种吸虫是对人类和动物造成严重危害的人兽共患寄生虫[1]。据估计仅亚洲就有7.5 亿人有感染鱼源性吸虫的风险，给公共卫生安全带来巨大的威胁[2]。本研究室在前期对乌裕尔河流域淡水鱼的吸虫囊蚴调查时发现并鉴定了3 种形态的吸虫囊蚴，分别为华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）、东方次睾吸虫（Metorchis orientalis）和日本全冠吸虫（Holostephanus dubinini）[3]。

华支睾吸虫（C. sinensis）是鱼源性吸虫的代表虫种，全球约有3 500 万人感染华支睾吸虫病，主要分布于亚洲，是一种十分重要的人兽共患寄生虫[4]。华支睾吸虫寄生于宿主的胆囊和肝胆管内，可引起宿主胆管炎、胆结石和肝硬化，还可诱发胆管上皮细胞癌，已被国际癌症研究机构分类为I 类生物致癌物[4]。东方次睾吸虫（M. orientalis）主要寄生于家禽和一些哺乳动物（包括人）的胆囊和胆管内，可引起与华支睾吸虫相似的临床症状。关于东方次睾吸虫病的报道较少，我国报道主要见于江苏省和福建省[5]。由于其与华支睾吸虫的生活史和临床症状极其相似，临床上东方次睾吸虫病极易被误诊为华支睾吸虫病，因此，东方次睾吸虫是一种易被忽视的人兽共患寄生虫。日本全冠吸虫（H. dubinini）是一种主要感染禽类的吸虫，寄生于宿主的肠道，可引起宿主贫血，消瘦和共济失调等临床症状，关于该虫的报道较少，中国偶有关于日本全冠吸虫感染禽类的报道[6]。

虽然3 种吸虫成虫的形态易于区别，但寄生于淡水鱼体内的吸虫囊蚴形态极其相似，需要具有丰富临床经验的专业人员才可以区分，而且形态学鉴定为主观判断，易造成误判。因此，依靠形态学鉴定淡水鱼吸虫囊蚴有很大局限。那璐等报道了一种检测家禽粪便中东方次睾吸虫虫卵的PCR 方法，并对临床样品进行了检测，该方法与已知阴阳性样品的符合率为100%[7]。杨庆利等基于核糖体ITS 和线粒体COX1 基因建立了一种鉴别华支睾吸虫囊蚴的分子诊断方法[8]。但是关于这3 种囊蚴的多重PCR 方法还未见报道。因此，本研究建立一种可以鉴别检测华支睾吸虫、东方次睾吸虫和日本全冠吸虫3 种吸虫囊蚴的多重PCR 方法，为鱼源性吸虫囊蚴的检测提供技术手段。

1 材料与方法

1.1 吸虫囊蚴华支睾吸虫囊蚴、东方次睾吸虫囊蚴和日本全冠吸虫囊蚴均收集于乌裕尔河流域淡水鱼，由本实验室分离鉴定并保存；鸭对体吸虫、舟形嗜气管吸虫、横川后殖吸虫和卷棘口吸虫由本实验室保存。

1.2 主要试剂组织DNA 小剂量提取试剂盒购自OMEGA bio-tek 公司；ExTaqDNA 聚合酶、DL2000 DNA Marker、pMD18-T 均购自宝生物工程（大连）有限公司；DH5α 感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司；DNA Gel Extraction Kit 和Plasmid Miniprep Kit 均购自康宁生命科学（吴江）有限公司。

1.3 引物设计根据GenBank 中登录的华支睾吸虫的线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位V（nad5）（KC170241）、东方次睾吸虫的线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位II（nad2）（KT239342）和日本全冠吸虫的核糖体内转录间隔区（ITS）（AY245707）基因序列，利用Primer5.0 分别设计特异性引物（表1），由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 3种吸虫囊蚴特异性引物序列信息Table 1 Specific primer sequences for the three kinds of trematode metacercariae

1.4 目的基因的扩增及重组质粒标准品的构建参照文献[9]分别提取3 种吸虫单囊蚴的总DNA，以其为模板进行单一PCR 扩增。反应体系均为25 μL：其中10×Ex Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物（500 nmol/L）各0.5 μL，DNA 模板1 μL，ExTaqDNA聚合酶0.2 μL，加ddH2O 调整总体积至25 μL。PCR反应条件为：92 ℃2 min；92 ℃30 s、51 ℃30 s、72 ℃30 s，共30 个循环；72 ℃7 min。PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。扩增获得的3 种吸虫囊蚴的目的基因片段分别克隆于pMD18-T 载体，构建的重组质粒由生工生物工程（上海）有限公司测序，测序结果通过与GenBank 中登录的相应基因序列进行BLAST 同源性对比分析无误后，利用超微量核酸蛋白分析仪测定重组质粒的浓度，计算的拷贝数后作为质粒标准品用于后续试验。

1.5 多重PCR 方法的建立及反应条件的优化将3种吸虫囊蚴质粒标准品统一稀释为107拷贝/μL 后等比混合作为模板，采用方阵法对多重PCR 反应的引物浓度（300 nmol/L～600 nmol/L）和退火温度（49 ℃～53 ℃）进行优化。每次试验均设置ddH2O 阴性对照。PCR 扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 特异性试验以参照文献[9]分别提取的鸭对体吸虫、舟形嗜气管吸虫、横川后殖吸虫和卷棘口吸虫4 种常见吸虫的基因组DNA，以及华支睾吸虫、东方次睾吸虫、日本全冠吸虫质粒标准品等比混合后为模板，并以ddH2O 为阴性对照，采用已优化的多重PCR条件进行检测，以评价该方法的特异性。

1.7 敏感性试验将浓度为107拷贝/μL 的华支睾吸虫、东方次睾吸虫和日本全冠吸虫质粒标准品10倍倍比稀释后，利用已优化的多重PCR 方法进行检测，以评价该方法的敏感性。

1.8 临床样品检测于黑龙江各地随机采集52尾淡水鱼，采用组织DNA小剂量提取试剂盒提取其肌肉组织DNA为模板，利用本研究所建立的多重PCR方法检测，同时利用鱼肉消化法结合囊蚴形态学鉴定法[3]检测，将检测结果与本研究所建立方法的检测结果比较分析。

2 结 果

2.1 PCR 反应条件的优化结果通过对反应体系中引物浓度和退火温度的优化，确定最佳反应体系为：10×Ex Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，3 种吸虫囊蚴的引物各0.5 μL，质粒DNA 模板各0.2 μL，ExTaqDNA 聚合酶0.2 μL，加ddH2O 调整总体积至25 μL。PCR 最佳反应条件为：92 ℃2 min；92 ℃30 s、51 ℃30 s、72 ℃30 s，共30 个循环；72 ℃7 min。经电泳检测可观察到在约500 bp（东方次睾吸虫）、300 bp（华支睾吸虫）和200 bp（日本全冠吸虫）处各有单一的条带，与预期产物大小相符（图1）。采用3对引物对混合模板进行扩增，结果显示，3 种吸虫囊蚴均出现单一条带，且易于区分（图2），表明该多重PCR 方法可以用于不同吸虫囊蚴的检测。3 种重组质粒由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，结果显示3 条插入目的基因分别为508 bp，311 bp 和208 bp，基因序列与NCBI 数据库中登录的相应吸虫基因同源性均为100%，表明重组质粒标准品构建正确。经计算重组质粒浓度分别为1.03×108拷贝/μL、2.52×108拷贝/μL 和1.24×108拷贝/μL。

图1 单一PCR扩增结果Fig.1 Results of single PCR amplification

图2 多重PCR扩增结果Fig.2 Results of multiplex PCR amplification

2.2 多重PCR 方法的特异性试验结果利用本研究建立的多重PCR 方法检测3 种吸虫囊蚴和其他4种常见吸虫，结果显示华支睾吸虫、东方次睾吸虫和日本全冠吸虫均出现大小相符的目的条带，而其他种吸虫的扩增结果均为阴性（图3），表明本研究建立的多重PCR方法具有较强的特异性。

图3 多重PCR特异性试验结果Fig.3 Specificity test of the multiplex PCR

2.3 多重PCR 方法的敏感性试验结果本研究对5个稀释度的3 种吸虫囊蚴的重组质粒标准品进行检测。结果显示，该方法对东方次睾吸虫和华支睾吸虫重组质粒标准品的检测下限为104拷贝/μL，而日本全冠吸虫重组质粒标准品DNA为103拷贝/μL 时仍能检测出条带（图4）。表明3 种吸虫囊蚴在模板浓度为104拷贝/μL 时均能检测到目的条带，因此本研究建立的多重PCR 检测方法具有较高的敏感性。

图4 多重PCR敏感性试验结果Fig.4 Sensitivity test of the multiplex PCR

2.4 临床样品的检测利用本研究建立的多重PCR方法对52 尾淡水鱼肌肉组织DNA 进行检测，结果显示共有30 尾淡水鱼感染吸虫囊蚴，感染率为42.3%。其中无东方次睾吸虫囊蚴单独感染的情况，华支睾吸虫囊蚴单独感染阳性样品4 份，日本全冠吸虫囊蚴单独感染阳性样品1 份，多数样品呈两种或3 种吸虫囊蚴混合感染（表2）。本研究建立的多重PCR 检测方法的结果与传统形态学鉴定的结果一致，表明本研究所建立的多重PCR方法可用于临床样品检测，且表明淡水鱼中这3种吸虫感染率较高，应给予重视。

表2 临床样品多重PCR的检测结果Table 2 The detection results of clinical samples by the multiplex PCR assay

3 讨 论

本实验室前期调查发现，乌裕尔河流域淡水鱼中含有大量吸虫囊蚴，主要为华支睾吸虫囊蚴、东方次睾吸虫囊蚴和日本全冠吸虫囊蚴[3]。这些吸虫囊蚴形态十分相似，易造成误判。吸虫囊蚴鉴定另一种可靠的方法是将囊蚴人工接种动物，进行动物还原实验，再通过对成虫的形态学鉴定，来反向鉴定囊蚴的种类，该方法虽然能对囊蚴准确鉴定，但耗时耗力，鉴定的数量和种类不易太多，存在不适合流行病学调查和大面积推广等缺点[10]。

随着分子生物学技术的发展，PCR 技术已广泛应用于病原的快速检测。与常规检测技术相比，该方法不仅缩短了检测时间，而且节约了人力和物力，为病原的快速检测提供了可靠的依据。因此，本研究建立了多重PCR 方法检测这3 种淡水鱼吸虫囊蚴，该方法具有特异性强和敏感性高的优势，解决了常规检测中误检、漏检和耗时等问题，可准确检测到3 种吸虫囊蚴的存在。在建立多重PCR 方法中，特异性引物的设计是关键。本研究中由于华支睾吸虫和东方次睾吸虫均属于后睾科成员，且基因序列十分相似。因此，在引物设计时通过大量标记基因的比对分析，最终确定了针对两种吸虫线粒体中变异性较大的nad2和nad5基因设计引物，经多次重复实践改良，最终选取了特异性最强的引物，避免了引物二聚体的产生，并且目的片段清晰。特异性试验结果也证实了本研究选择引物的特异性，且该方法与其他常见寄生虫无交叉反应。

先前研究表明PCR 方法可检测到单个虫卵1∶16倍稀释后的样品浓度[7]，本方法敏感性试验表明3 种吸虫囊蚴在模板浓度为104拷贝/μL时均能检测到目的条带，可见本研究建立的多重PCR检测方法可满足检测到一个囊蚴的要求，具有较高的敏感性。

本研究建立的多重PCR 方法可同时检测华支睾吸虫、东方次睾吸虫和日本全冠吸虫，操作简单快速，且具有较好的敏感性和特异性。利用该方法对淡水鱼样品进行检测，结果显示该方法与传统的形态学检测方法结果一致。本研究首次建立的该多重PCR 方法为鱼源性吸虫病的快速检测及鉴别诊断提供了重要的技术手段，为预防鱼源性寄生虫病奠定了基础，具有重要的社会公共卫生学意义。