血管新生因子bFGF和miR-210与脑微出血的相关性

刘美玉 郭 霞 吴丽娥 武俊平 贾 璐 张 佳 雍 雯 于文龙 白茹玉 禹延雪

内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院，内蒙古 包头 014010

脑微出血（cerebral microbleeds，CMBs）是脑小血管病变导致血管周围含铁血红素沉积的显微病理结果［1］，其影像表现主要是由于病理性铁蓄积导致局部磁化率的改变，在T2加权或磁敏感加权（SWI）成像上表现为直径2～5 mm 的圆形低信号病灶［2］。

CMBs无明显的临床表现，但其不断进展会引发相关不良后果。至今已有大量研究发现，CMBs是导致血管认知功能下降、精神障碍、步态异常等临床损害以及反复出血性或缺血性脑卒中、脑淀粉样血管病、阿尔茨海默病、帕金森病等神经科多种疾病的重要危险因素［1，3-5］。由于CMBs病理、影像检查的局限性，使其在早期诊断、检测疾病进展方面受到很大限制，也促使更多研究者把研究重点放在与CMBs相关的生物标记物上。本文重点关注血清碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和微小RNA-210（microRNA-210，miR-210）等血管新生因子与CMBs间的相关性，期望为预测、治疗CMBs提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2018-12—2021-06 包头医学院第一附属医院神经内科非急性脑血管病住院患者，行头颅磁共振磁敏感成像（MRI-SWI）并签署知情同意书。

纳入标准：（1）年龄≥40岁；（2）经头颅MRI检查确诊CMBs，符合中国脑小血管病诊治专家共识2021中CMBs的诊断标准；（3）发病时间＞4周。

排除标准：（1）急性脑梗死、脑出血或蛛网膜下腔出血患者；（2）动静脉畸形、海绵状血管瘤、毛细血管扩张症、脑淀粉样血管病、多发性硬化、视神经脊髓炎、进行性多灶性白质脑病等患者；（3）合并严重心、肺、肝、肾衰竭者；（4）不能配合完善头颅MRI 检查者。

CMBs 影像诊断标准［6］：（1）圆形或卵圆形、边界清楚、均质性、信号缺失灶；（2）直径2～5 mm，最大不超过10 mm，周围无水肿；（3）病灶被非脑沟区脑实质围绕；（4）T2*GRE 序列上显示高光溢出效应；（5）微出血灶在相应部位的T1、T2序列上未显示出高信号；（6）排除钙化、铁沉积、骨头、海绵状血管瘤、小血管流空影等其他原因；（7）影像学上除外弥漫性轴索损伤。

1.2 研究方法 记录患者基本信息，包括年龄、性别、既往史、个人史，采用西门子3.0T 磁共振成像仪进行头颅MRI检查，由经验丰富的2名影像科医师及2 名神经内科医师读片明确是否脑微出血并做好记录。抽取所有入组患者空腹静脉血7 mL，4 mL用于实验室检测，2 mL用于血清bFGF浓度检测。采用人bFGF Quantikine ELISA 试剂盒检测，实验过程严格参照产品说明书。1 mL用于miR-210相对表达量检测，应用实时荧光定量PCR 技术测定：①总RNA 提取：TRNzol法提取总RNA；②反转录：将8 μL总RNA样本与10 μ L 2×miRNA RT Reaction Buffer、2 μ L miRNA RT Enzyme Mix 混合制成反应体系20 μL 的混合液，将混合液置于以下培育条件进行逆转录：42 ℃×60 min，95 ℃×3 min，将得到的cDNA反应液用RNase-Free ddH2O 稀释至200 倍置于冰上备用。③RT-PCR：取miRNA第一链cDNA 2 μL于冰上混合2 × miRcute Plus miRNA PreMix 10 μ L、Forward Primer 0.4 μL、Reverse Primer 0.4 μL，并用7.2 μL ddH2O 补足反应体系为20 μ L 的混合液。将Real-Time PCR 仪设置扩增条件：95 ℃×15 min、94 ℃×20 s、60℃×34 s过程共进行40个循环，记录各组标本扩增曲线、溶解曲线、CT 值。④从miRNA 数据 库（http：//www.mirbase.org）查 找 所 要 研 究 的miRNA的序列。miR-210：5̍-TTAATGCTAATCGTGA CT-3̍；U6：5̍-CTCGCTTCGGCAGCACA-3̍。所有引物均由北京天根生化科技有限公司提供。⑤2-△△CT进行实时荧光定量分析：△CT=CT 目的基因—CT 内参基因；△△CT=△CT实验组—△CT对照组；待测样品相对浓度=2-△△CT。

1.3 统计学方法 使用SPSS 26.0 进行数据分析。符合正态分布的计量资料采用t 检验，以均数±标准差（±s）表示，非正态分布采用秩和检验，以M（P25，P75）表示，计数资料采用χ2检验，用率（%）表示。危险因素分析采用多因素Logistic 回归分析。应用ROC曲线下面积评价bFGF、miR-210 对CMBs 的预测价值。所有统计采用双侧检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2 组一般资料比较 共纳入患者335 例，根据SWI 检查结果分为CMBs 组176 例，非CMBs 组159例。2 组性别、年龄、BMI、吸烟史、饮酒史、糖尿病、缺血性心脏病、房颤史等比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。CMBs组高血压、缺血性脑卒中患病率及腔隙性梗死（LI）灶、白质病变（WMLs）评分高于非CMBs组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 CMBs组与非CMBs组一般资料比较Table 1 Comparison of general data between CMBs group and non-CMBS group

2.2 2组bFGF、miR-210水平比较 CMBs组bFGF、miR-210 水平均较非CMBs 高，2 组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 2组bFGF、miR-210水平比较Table 2 Comparison of bFGF and miR-210 levels between two groups

2.3 CMBs 的独立危险因素 Logistic 回归分析显示，校正高血压、缺血性脑卒中、LI 灶、WMLs 评分的影 响，bFGF（OR=1.313，95% CI：1.208～1.427）、miR-210（OR=2.110，95% CI：1.555～2.862）是CMBs的独立危险因素（P＜0.05）。见表3。

表3 CMBs组和非CMBs组患者危险因素多因素Logistic回归分析Table 3 Multivariate Logistic regression analysis of risk factors of patients in CMBs group and non-CMBS group

2.4 bFGF、miR-210对CMBs的预测价值 ROC曲线分析显示，bFGF 浓度预测CMBs 的AUC 为0.937（95% CI 0.910～0.965），约登指数为79.4%，最佳截断值为48.95 pg/mL，敏感度92.6%，特异度为86.8%。miR-210 相对表达量预测CMBs 的AUC 为0.873（95% CI 0.833～0.913），约登指数为68.7%，最佳截断值为1.72，敏感度92.0%，特异度为76.7%（P＜0.05）。见图1。

图1 bFGF、miR-210对CMBs的预测价值Figure 1 Prediction value of bFGF and miR-210 on CMBs

3 讨论

CMBs 危险因素及发病机制目前尚不能完全明确，既往研究认为可能与年龄、性别、高血压、糖尿病、高脂血症等众多因素有关［7］，血-脑屏障损伤、内皮功能障碍、β淀粉样物质沉积、炎性反应、基因多态性等均可能参与CMBs 的发生［8-9］。本研究显示，高血压、腔隙性梗死灶数量、白质病变评分、血管新生因子bFGF 及miR-210 是CMBs 的危险因素。既往研究证实，血管新生可能作为不同病因引起CMBs的共同病理生理机制参与CMBs 的发生［10］。血管新生是在缺氧或炎症细胞募集、血管生成促进因子产生的环境下，基底膜降解，内皮细胞迁移、增殖和分化以及在血管支持细胞的调节下形成新血管的过程［11］。

碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是一种重要的促进血管生成因子，主要对内皮细胞发挥作用，产生细胞存活、运动和增殖的信号，导致血管生成［12-13］，还可诱导微血管内皮细胞产生大量的纤维蛋白溶酶原激活剂，促使内皮细胞形成新的毛细血管芽［14］。在肿瘤［15］及大脑低氧低灌注［16］中均发现，bFGF增高可促进新生血管形成。视网膜和大脑中的微血管系统在胚胎学起源、解剖学特征、代谢活动以及血管化模式上有共同之处［17］，其病变一定程度上可以反映脑小血管改变。CMBs作为一种脑小血管病，其发病机制与糖尿病视网膜病变相似。有研究发现，bFGF作为极强的促血管生成因子，几乎作用于新生血管形成的全过程，在糖尿病视网膜病变的早期发挥了重要作用［18］。本研究显示，CMBs 组bFGF 水平较非CMBs 组高，与CMBs 具有相关性，与以往研究结果相符；Logistic 回归分析排除高血压等干扰因素后，证实bFGF水平升高增加CMBs发生风险，是CMBs的独立危险因素，且ROC曲线显示bFGF浓度预测CMBs的AUC为0.937，对CMBs有较高预测价值，因此，推测bFGF可能参与CMBs发生过程，可作为CMBs的预测指标。

miR-210是一种低氧特异性miRNA，在缺氧环境下表达较为稳定，在缺血后血管新生过程中发挥重要 作 用［19］。GONZALEZ-KING 等［20-21］研 究 发 现，miR-210 可通过缺氧诱导因子HIF-1α的调控作用促进组织血管生成。CHEN 等［22］发现miR-210 可靶向作用于成纤维细胞生长因子受体1（recombinant fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1），而bFGF与其受体结合后参与毛细血管基底膜降解、内皮细胞迁移增生、胶原合成、小血管腔形成等过程。新生血管由于结构尚不完整，有容易发生破裂、出血的特点［23］；另外，血管新生早期血-脑屏障通透性增加，造成血液成分外渗等一系列相关反应［24］。已有研究证实，血管新生、血-脑屏障损害及内皮功能障碍是CMBs 发生的重要机制［8］。本研究显示，血管新生因子miR-210 在CMB 组水平较非CMBs 组高，与CMBs存在显著关联，是CMBs的独立危险因素，miR-210作为血管新生因子可能是CMBs发生的潜在机制之一，与上述结论一致。

众多研究表明，随着年龄的增长，CMBs 发生风险也随之增加［25］，男性CMBs 的发病率较女性高［26］。本研究未发现年龄、性别对CMBs 的影响，但其现实意义仍不可忽略，尤其在现今社会，过度肥胖、男性吸烟、饮酒嗜好均是心脑血管疾病的危险因素，还需要更多的样本分析其与CMBs发病的关系。

血清bFGF、外周血miR-210 与CMBs 相关，可预测CMBs 的发生。本研究尚存在不足之处，未进行CMBs 部位及数量分型研究，有待分析bFGF、miR-210在不同数量、部位CMBs中表达量，期望从研究分子致病机制出发进一步探究miR-210、bFGF 致CMBs的具体机制。