LOXL1和LOXL2基因在恶性胸膜间皮瘤中的表达及临床意义

李 彬，杨 娜，李素芬，普元倩，张 态，自加吉，李正亮，熊 伟

0 引 言

间皮瘤是一种来源于胸膜或其他部位间皮细胞的罕见肿瘤，其中来源于胸膜的约占81%，其他部位包括腹膜、心包和睾丸鞘膜等[1-2]。恶性胸膜间皮瘤(malignant pleural mesothelioma, MPM)初诊时多为晚期，治疗困难，疗效欠佳，患者中位总生存时间约为1年，5年生存率约为10%，治愈病例罕见[3]。石棉暴露是诱发MPM的主要原因，由于发达国家的石棉使用历史较长以及发展中国家仍在继续生产使用石棉，导致全球MPM发病率及死亡率仍呈现上升趋势，其中，国外以澳大利亚、英国和南非发病率最高，中国以云南省发病率最高[4-5]。尽管目前的医疗技术有着较快的发展，但是对于MPM的诊断仍为胸腔镜活检或CT，临床上尚缺乏低痛、便捷，能进行MPM早期诊断的特异性诊断方法[6-7]。因此，MPM的预防、早期诊断和靶向治疗已成为研究的热点。

赖氨酰氧化酶(lysyloxidase,LOX)家族包括LOX和赖氨酰氧化酶样蛋白1～4(lysyl oxidase-like protein 1～4,LOXL1～4)五个成员，是一类铜依赖性单胺氧化酶，能够稳定细胞外基质(extracellular matrix, ECM)，保持ECM结构的完整性[8]。研究发现，LOX家族成员还具有其他一些新的功能，并且可能与肿瘤的发生和发展密切相关，既可能与肿瘤抑制有关，也可能促进肿瘤的发生与进展[9]。有研究报道，LOXL1基因和LOXL2基因在胃癌[10-11]、结直肠癌[12-13]和前列腺癌[14]等多种类型的恶性肿瘤中均呈现高表达，且提示LOX基因家族有望成为预后评估的新型肿瘤标志物。目前，对于LOXL1与LOXL2基因在MPM组织的表达差异及作用机制尚不明确。因此，本研究旨在探讨LOXL1和LOXL2基因mRNA在MPM组织中的表达及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象回顾性收集2017年6月至2019年12月大理大学第一附属医院胸外科12例MPM患者的癌组织和配对相邻正常胸膜组织(距癌组织5 cm)。男9例，女3例，年龄45.0～76.0岁，平均年龄为(64.2±10.4)岁。病理诊断为MPM肿瘤组织标本，而相邻组织被诊断为无癌症或炎性细胞浸润。将所有新鲜组织保存在液氮中。从大理大学第一附属医院影像科分别收集12例正常对照人群和12例确诊为MPM患者的胸部CT图像，通过分析MPM患者的影像学特征，探明MPM的肿瘤情况及肿瘤的浸润程度。本研究已获得大理大学医学伦理委员会的批准(批准号：2020-YXLL20)，患者均已签署知情同意书。

1.2RT-qPCR检测MPM组织和正常组织中LOXL1和LOXL2基因mRNA表达水平使用TRIzol试剂(Invitrogen)从人正常胸膜组织和MPM组织中提取总RNA并检测其浓度，A260/A280在1.8～2.0之间。采用qPCR RT Master Mix(Toyobo)将总RNA(1 μg)反转录为cDNA。cDNA合成的流程如下：25 ℃ 5 min，42 ℃ 20 min，96 ℃ 1min。使用SYBR Premix Ex Taq(Takara)进行RT-qPCR分析，引物序列见表1。PCR产物用Mx3000P QPCR系统进行监控。热循环条件如下：95 ℃预变性3 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。以18S rDNA基因表达量为内参，均设置3个复孔，采用2-△△Ct法计算目的基因mRNA相对定量结果。实验重复3次。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3Oncomine数据库分析LOXL1和LOXL2基因在MPM组织与正常组织中的表达差异在Oncomine数据库[15]中设置搜索条件为：①“Gene:LOXL1&LOXL2”；②“Analysis type: cancer vs. normal analysis③“Cancer type: other cancer-mesothelioma-pleural malignant mesothelioma ”；④“Sample type: clinical specimen”，获取正常肺组织、正常胸膜组织与MPM组织中LOXL1和LOXL2基因的表达差异。

1.4在TCGA数据库中下载MPM数据集使用R4.0.2软件的cgdsr函数包从TCGA(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaHome2.jsp)数据库下载MPM数据集，包括LOXL1和LOXL2基因mRNA 表达 RNA SeqV2 数据(meso_tcga_pan_can_atlas_2018_rna_seq_v2_mrna)及其患者对应的病理资料(meso_tcga)，通过TCGA病例ID将对应的两组数据进行合并。

1.5TCGA MPM数据集筛选和临床病理特征的相关性分析TCGAMPM数据集共包含87例MPM样本，根据mRNA二代测序结果分析，MPM组织样本中LOXL1基因的表达量为172.96 ～ 10 443.5，中位数为1 453.16。LOXL2基因的表达量为71.256 ～ 24 956.2，中位数为1813.98。分别以基因表达量中位数为界限，样本LOXL1和LOXL2基因表达量高于中位数，则定义为高表达；反之，则定义为低表达。MPM组织中LOXL1和LOXL2基因高表达组44例，低表达组43例。通过R4.0.2软件Epicalc函数包分析LOXL1和LOXL2基因表达量与临床病理学参数相关性。

1.6MPM的病理分型TCGA数据库中MPM的病理分型为3种，分别是肉瘤样型、上皮样型和双相混合型。MPM数据集中包括肉瘤样型2例、上皮样型57例、双相混合型23例。

1.7LOXL1和LOXL2基因mRNA表达水平与MPM患者预后的相关性采用GraphPad Prism 8.01软件构建Kaplan-Meier模型并进行Logrank法检验，探究LOXL1和LOXL2基因mRNA表达量对MPM患者总生存率(overallsurvival, OS)和无疾病进展生存率(disease-free survival, DFS)的影响。

1.8LOXL1和LOXL2基因表达的相关性研究根据Kim等[16]的报道，选择MPM的6种肿瘤标志物基因，分别是人类表皮生长因子含腓骨样胞外基质蛋白1(epidermal growth factor containing fibulinlikeextracellular matrix protein 1, EFEMP1)、间皮素(mesothelin, MSLN)、钙结合蛋白2(calbindin 2, CALB2)、硫酸酯酶1(sulfatase 1, SULF1)、血小板反应蛋白2(thrombospondin 2, THBS2)和钙粘蛋白11(cadherin 11, CDH11)。同时，LOX基因家族还有其它成员，分别为LOX、LOXL3～4。通过基因表达谱动态分析(gene expression profiling interactive analysis, GEPIA)(http://gepia2.cancer-pku.cn)数据库在线检索基因相关性分析，分别得出LOXL1和LOXL2基因表达与其它基因表达的相关性可视化分析图。

1.9统计学分析采用R studio 4.0.2 和GraphPad Prism 8.01进行统计学分析及作图。不符合正态分布的计量资料采用M(P25～P75)表示，计数资料用百分比(%)表示。正常组织和MPM组织的LOX基因表达水平的组间比较采用t检验。临床病理参数相关性分析，组间比较采用χ2检验及Fisher精确概率法。生存分析采用 Kaplan-Meier模型和Logrank法检验。单因素和多因素分析采用 Cox风险比例回归模型。采用Pearson法进行基因表达的相关性分析。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MPM患者组与正常对照组胸部CT的影像学特征与正常胸部CT比较，MPM患者双侧胸腔内见水样密度影，右肺组织受压，体积缩小，右上纵隔旁、右侧胸膜区、右上纵隔内多发软组织结节影及肿块影，密度尚均匀，边界模糊，与右侧胸膜分解不清，右侧胸膜明显增厚，纵隔内多发肿大淋巴结，气管开口通畅，未见确切异常密度影。见图1。

2.2RT-qPCR检测人正常胸膜间皮组织和MPM组织中LOXL1及LOXL2 mRNA表达差异与正常胸膜组织比较，MPM组织中LOXL1、LOXL2基因的mRNA表达量明显升高(P<0.01)。见图2。

2.3LOXL1与LOXL2基因mRNA在MPM组织中的表达量高于正常组织采用Oncomine数据库对基因进行筛选分析，根据Gordon等[17]研究结果显示，正常组织和MPM组织共有49例样本。与正常肺组织、正常胸膜组织比较，LOXL1基因在MPM组织中呈现显著高表达(P<0.01, Fold Change:5.043)，LOXL2基因在MPM组织中同样呈现显著高表达(P<0.01, Fold Change:1.852)。见图3。

a:正常胸腔肺窗平扫；b:正常胸腔纵隔平扫；c:MPM患者胸腔肺窗平扫；d:MPM患者胸腔纵隔平扫

a: LOXL1；b: LOXL2

a:LOXL1mRNA表达量；b: LOXL2 mRNA表达量

2.4MPM组织中LOX基因mRNA的表达量与临床病理参数的相关性LOXL1基因mRNA表达量与MPM患者的年龄、性别等均无显著相关性(P>0.05)，LOXL2基因mRNA表达量与MPM患者的肿瘤类型有显著相关性(P<0.01)。见表2。

表2 LOXL1和LOXL2基因mRNA表达量与MPM患者临床病理特征的相关性(n=87)

2.5LOXL1和LOXL2基因mRNA高表达提示MPM患者预后不良Kaplan-Meier生存分析结果显示，MPM患者LOXL1基因的mRNA表达量对OS有显著影响(P=0.016)，LOXL1基因高表达的中位生存时间较低表达明显缩短(11.87个月vs19.99个月,P<0.001)。同时，LOXL1基因mRNA的表达量对MPM无疾病进展生存率无显著影响(P=0.06)。结果提示LOXL1基因mRNA的表达量越高的患者，总体生存时间越短。见图4。

MPM患者LOXL2基因的mRNA表达量对OS有显著影响(P<0.001)，LOXL2基因高表达的中位生存时间较低表达明显缩短(12.72个月vs26.14个月,P<0.001)。LOXL2基因mRNA的表达量对于MPM患者的无疾病进展生存率有显著影响(P<0.05)，高表达的中位生存时间比低表达显著缩短(10.68个月vs21.86个月,P<0.001)。结果提示，LOXL2基因mRNA在MPM组织中表达量越高，患者总体生存时间和无疾病进展生存时间均显著缩短；反之，LOXL2基因mRNA表达量越低的MPM患者，患者总体生存时间和无疾病进展生存时间均显著提高。见图4。

2.6影响MPM患者预后因素的Cox多因素分析对87例MPM患者预后的影响因素进行Cox比例风险回归分析，单因素分析结果显示，LOXL1、LOXL2基因的高表达与肿瘤类型对于MPM患者的预后具有显著相关性(P<0.05)。将上述有统计学意义的因素纳入 Cox 多因素回归分析结果提示，LOXL1基因和LOXL2基因的高表达是导致MPM患者预后不良的影响因素，上皮样型MPM预示着MPM患者预后良好(P<0.05)。见表3。

a、b: LOXL1; c、d: LOXL2

表3 影响87例MPM患者预后的临床病理特征的单因素和多因素分析

2.7LOXL1和LOXL2基因与MPM肿瘤标志物基因和其他LOX家族基因表达的相关性在MPM中，LOXL1基因表达与EFEMP1(r=-0.25,P=0.021)、MSLN(r=-0.35,P<0.001)、CALB2(r=-0.36，P<0.001)、THBS2(r=0.32，P=0.003)和CDH11基因(r=0.25,P=0.018)表达具有显著相关性，与SULF1无显著相关性(r=0.059,P=0.59)。同时，LOXL2基因表达与MSLN(r=0.089)、CALB2(r=-0.39)、THBS2(r=0.55)和CDH11(r=0.45 )基因表达具有显著相关性(P<0.001)，与EFEMP1(r=0.41 ，P=0.41)和SULF1(r=-0.045，P=0.68)基因表达无显著相关性。LOXL1基因表达与LOXL2(r=0.22,P=0.041)、LOXL4(r=0.3,P=0.004)基因具有显著正相关。LOXL2基因表达与LOX(r=0.65，P<0.001)、LOXL1(r=0.22,P=0.041)和LOXL4(r=0.37，P<0.001)基因表达具有显著正相关。

3 讨 论

MPM是一种预后差的高侵袭性肿瘤，多发生在50～70岁，男性多见，且近年来的发病率正逐年上升[18]。2020年全球MPM新发病例数为30 870 例，占全球新发恶性肿瘤的0.2%，死亡病例数为26 278例，占全球恶性肿瘤死亡病例数的0.3%[3]。MPM的发病原因主要为石棉暴露，尽管石棉已经被大多数国家禁止使用及生产，但是中国依然是石棉最大的使用国家，暴露人群常暴露于石棉的20～40年后发病[19]。MPM 起源于胸膜，并侵犯周围组织器官，由于胸膜的病变位置、大小以及MPM特殊的发展方式，导致准确评估MPM患者的瘤体大小和肿瘤浸润程度十分困难，也给MPM患者的诊断以及后续治疗提出了较大的挑战。因此，迫切需要发现一种新型的早期诊断方法对MPM患者进行及早检出。

LOX家族是一类细胞外铜依赖型胺氧化酶，其中包含5个成员，分别为LOX和LOXL1～4。研究显示，LOX基因家族不仅参与机体内正常的生理活动，并且与肿瘤的发展、侵袭转移密切相关，有望成为新型的肿瘤标志物或治疗靶点[20]。据报道，LOXL1基因在肾细胞癌[21]、膀胱癌[22]中呈现低表达，而在肺腺癌[23]、前列腺癌[24]和涎腺腺样囊性癌[25]中呈现高表达。LOXL2基因在食管鳞状细胞癌[26]、肺癌[27]、肝癌[28]等肿瘤中均呈现高表达。然而，LOXL1及LOXL2基因表达与MPM发生发展的关系尚不明确。本研究结果显示，LOXL1及LOXL2基因的表达量在MPM组织中均呈现显著增高，结果提示LOXL1及LOXL2可能是与MPM发生发展相关的癌基因。最近，Kim等[16]报道LOX家族成员可作为MPM的潜在诊断标志物，与非MPM组织相比，LOX、LOXL1、LOXL2和锌指蛋白FOG家族成员2(Zinc finger protein, FOG family member 2, ZFPM2)在MPM组织中的表达量均显著增加，与本研究结果一致。通过病理参数的相关性分析得出，LOXL2基因的表达与肿瘤类型有显著相关性，上皮样型MPM中的表达水平显著低于双相混合型及肉瘤型MPM。现有研究显示，LOX家族通过促进胶原交联、促进EMT、激活FAK/Src通路、促进转移前微环境形成等促进肿瘤进展，其异常表达与肿瘤预后密切相关[29]。Kaplan-Meier生存分析结果结合Cox风险回归模型进行多因素分析，我们推测其原因可能是LOXL1或LOXL2基因表达越高的MPM患者更容易发生肿瘤浸润和转移，进而影响病灶部位正常组织细胞的生长，且影响相应器官和组织的代谢机能，最终导致MPM患者的预后不良。有研究显示，根据MPM患者的不同临床病理分型，上皮样型的MPM患者约占所有MPM患者的80%，且上皮样型患者的预后明显优于双相混合型及肉瘤样型患者[30-31]，这与本研究结果一致。因此，LOXL1和LOXL2基因有望作为MPM的诊断标志物，有助于临床的早期诊断和预后判断。目前，有研究报道EFEMP1、MSLN、CALB2等基因可作为MPM诊断的肿瘤标志物[14]。本研究通过对比LOXL1与LOXL2基因表达与相关肿瘤的基因的表达相关性，结果表明LOX基因家族各成员之间可能是协调表达和相互作用的。MPM发病机制极为复杂，通过多个肿瘤标志物的联合应用可以更为准确有效地早期诊断MPM患者[32]。综上所述，LOXL1和LOXL2基因有望成为MPM诊断和预后评估的新型肿瘤标记物。

本研究结合临床MPM组织样本和肿瘤公共数据库中的MPM数据集进行分析，样本量较大，可信度较高，具有一定程度的代表性意义，但是研究局限于LOXL1和LOXL2基因mRNA 表达水平的检测，缺乏蛋白质水平的检测。在后续研究中，我们将通过免疫组化或Western blotting等方法检测MPM组织中LOXL1和LOXL2蛋白的分布情况和表达水平，深入探讨研究LOXL1和LOXL2蛋白在MPM发生和发展中的作用机制。同时，通过构建LOXL1或LOXL2基因敲除的MPM细胞系，进一步探讨其对于MPM细胞的增殖、侵袭和凋亡影响，以期为MPM的临床诊疗和预后评估提供更多的参考依据。