籽粒苋不同器官内源激素含量比较研究

高金秋，王刚强，林怡欣，龙丽君，陈子瑶

（白城师范学院 生命科学学院，吉林 白城137000）

0 引言

植物内源激素对植物生长发育具有重要的调控作用，但其含量极低.内源激素测定技术对研究植物生命活动有重要意义［1-2］.植物内源激素测定方法主要有生物测定法、理化测定法（色谱测定法和光谱测定法）和免疫检测法（RIA 和ELISA）.生物测定法简捷便利，但专一性差、灵敏度低；理化测定法专一性、灵敏度都要优于生物测定法，但所用仪器昂贵，样品处理复杂，操作人员技术要求高，花费时间长.近年来，随着科技的进步，ELISA测定植物激素技术逐渐成熟，这方面的报道也逐渐增多［3-5］.

籽粒苋（Amaranthus hypochondriacusL.），又名千穗谷，是苋科（Amaranthaceae）苋属（Amaranthus）一年生粮、饲、菜兼用型作物，其茎叶柔嫩，营养价值高，适口性好，纤维素含量低，是优质高产饲料作物［6-7］；籽粒苋种子中矿物质含量丰富，既富含大量钾、镁、钠、钙等元素，又富含微量铁、锌、锰、铬、镍、钴、硒等元素.近年来，国内关于籽粒苋栽培及功能研究逐渐增多［8-12］，但组织培养方面鲜见报道［13］.本研究通过酶标法比较籽粒苋不同器官内源激素含量，为籽粒苋组织培养、品种选育、转基因操作以及产业开发提供技术支持和前期基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

籽粒苋内源激素提取方案筛选以水浸24 h的R104籽粒苋种子为实验材料；籽粒苋不同器官内源激素测定以R104籽粒苋无菌苗为实验材料.R104籽粒苋种子由白城师范学院刘淑芹副教授惠赠.

1.2 实验试剂与药品

琼脂粉、乙醇、次氯酸钠、石油醚、二乙基二硫代氨基甲酸钠、甲醇（色谱纯）、氯化氢、氨水、三氯甲烷、聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、乙酸乙酯、氢氧化钠、正丁醇、冰醋酸、植物激素ELISA检测试剂盒（购于上海羽凡生物科技公司）等，以上所有试剂与药品除特殊标注外均为分析纯.

1.3 主要仪器设备

Spectra M2 多功能酶仪器（美国Molecular Devices 公司）、光照培养箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、TG-16台式高速冷冻离心机（四川蜀科仪器有限公司）等.

1.4 实验方法

1.4.1 籽粒苋处理

1.4.1.1 水浸24 h籽粒苋种子处理

称取0.5 g籽粒苋种子，放入50 mL 三角瓶内，每瓶加蒸馏水10 mL，25 ℃黑暗培养24 h，用滤纸把种子表面水分吸干，待用.

1.4.1.2 籽粒苋无菌苗制备方法

籽粒苋种子用70%酒精消毒1 min，无菌水冲洗1次，2%次氯酸钠消毒15 min，无菌水冲洗3次后接种于MS培养基上，放在光照培养箱内进行培养.培养温度为23～27 ℃，光照16 h/d.14 d后在超净工作台内切取胚根、胚轴、子叶、茎尖各1 g待用.

1.4.2 籽粒苋内源激素提取方案

将1.4.1.1所得种子材料参考陈义、胡晓辉等文献［14-18］，在不同温度、鲜材料、干材料、石英砂研磨、玻璃匀浆器研磨和研钵研磨等不同参试因子处理下，设计14 个处理组，如表1 所示.依照表1 进行植物材料预处理与细胞破碎后，按照文献［15］和文献［16］等的操作方法进行植物激素液相萃取，按照文献［17］和文献［18］的操作方法进行植物激素固相萃取.萃取后得籽粒苋内源玉米素（ZT）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）、总细胞分裂素（CTK）和总生长素（GH）.

表1 籽粒苋内源激素提取处理组合

植物激素粗提液制备方法：依照表1进行相应植物材料预处理与细胞破碎，加入浓度为30 mg/mL二乙基二硫代氨基甲酸钠5 μL 和5 mL 80%甲醇（-20 ℃预冷），转移至50 mL 离心管中，充分混匀后，4 ℃浸提24 h，1 000 g/min 4 ℃离心20 min，收集上清液.剩余沉淀加2 mL 80%甲醇（-20 ℃预冷），二次重复操作浸提、离心，收集上清液，弃去残渣，合并上清液.上清液中含籽粒苋内源ZT，ABA，GA，CTK和GH.

将14 个处理组（每组三次重复）所得籽粒苋内源ZT，ABA，GA，CTK 和GH 按照植物ZT ELISA 试剂盒、植物ABA ELISA 试剂盒、植物GA ELISA 试剂盒、植物CTK ELISA 试剂盒和植物GH ELISA 试剂盒操作说明书，分别进行ELISA测定.

1.4.3 籽粒苋不同器官内源激素的ELISA测定

用1.4.2 筛选出的最优方案对籽粒苋无菌苗胚根、胚轴、子叶和茎尖进行内源激素提取（三次重复）与ELISA测定.

2 结果分析

2.1 籽粒苋内源激素提取方案确定

检测1.4.2各处理下不同内源激素含量，比较内源激素得率及参试因子得率.

2.1.1 不同处理内源激素得率

检测1.4.2各处理组的各激素含量，统计其平均值绘制堆积柱形图，如图1所示.

图1 实验处理与激素含量关系

由图1可知，3号组-80 ℃冷冻4 h，加石英砂研磨，粗提液方案内源激素得率最高；4号组40 ℃烘干，加石英砂研磨，液相萃取方案内源激素得率最低.

2.1.2 参试因子与激素含量关系

结合2.1.1 实验结果，为进一步明晰各参试因子对籽粒苋内源激素得率的贡献，整理1.4.2 所得各参试因子单因素数据，绘制参试因子与激素含量关系图，如图2所示.

图2 参试因子与激素含量关系

由图2可知，鲜材料直接提取得率高于其他处理组；石英砂研磨细胞破碎法得率略高于研钵研磨处理；激素提取方式中粗提液检测效果要优于液相萃取和固相萃取.由此得出，籽粒苋内源激素的提取最佳方案为：鲜材料，石英砂研磨破碎细胞，制备粗提液用于ELISA检测.

2.2 籽粒苋不同器官内源激素含量的比较

籽粒苋无菌苗胚根、胚轴、子叶和茎尖用石英砂研磨，制备粗提液，ELISA测定其内源ZT，ABA，GA，CTK和GH含量，并进行比较.

2.2.1 不同器官ZT含量

ZT 含量检测结果如图3所示.由图3可知，各器官ZT 含量值茎尖＞胚根＞子叶＞胚轴.籽粒苋不同器官ZT 含量差异较大，其中以茎尖含量最高，可达40.43 pg/g，胚轴含量最低，为0.1 pg/g.子叶与胚根两器官相差最小，为1倍左右；茎尖ZT含量与胚轴、子叶或胚根ZT含量相差较大，是他们的5～400倍.

图3 籽粒苋各器官ZT含量

2.2.2 不同器官ABA含量

ABA 含量检测结果如图4 所示.由图4 可知，各器官ABA 含量值茎尖＞子叶＞胚根＞胚轴.籽粒苋ABA 含量最高器官为茎尖，可达302.85 ng/g，胚轴含量最低，低至2.44 ng/g.各器官ABA 含量相差较大，茎尖ABA含量是胚轴、胚根和子叶含量的46～124 倍.

图4 籽粒苋各器官ABA含量

2.2.3 不同器官GA含量

GA 含量检测结果如图5 所示.由图5 可知，各器官GA 含量值茎尖＞子叶＞胚轴＞胚根.籽粒苋GA含量最高器官为茎尖，可达12.388×103nmol/g，胚根含量最低，为0.5 nmol/g.各器官GA含量相差最大，茎尖GA含量是胚根、胚轴和子叶含量的82～25 000倍.

图5 籽粒苋各器官GA含量

2.2.4 不同器官CTK含量

CTK 含量检测结果如图6 所示.由图6 可知，各器官CTK 含量值茎尖＞子叶＞胚根＞胚轴.籽粒苋CTK含量最高器官为茎尖，可达155.48 ng/g，胚轴含量最低，低至6.61 ng/g.胚根、胚轴与子叶CTK含量差别不大，茎尖CTK含量是子叶、胚轴或胚根含量的14～24倍.

图6 籽粒苋各器官CTK含量

2.2.5 不同器官GH含量

GH 含量检测结果如图7 所示.由图7 可知，各器官GH 含量值茎尖＞子叶＞胚根＞胚轴.籽粒苋不同器官GH 含量差异较大，其中以茎尖含量最高，可达3.708 1×103pg/g，胚轴含量最低，为179.88 pg/g.胚根与胚轴相差最小，子叶与胚根、胚轴相差稍大，茎尖与胚根、胚轴、子叶相差最大，各器官GH 相差倍数在13～19倍之间.

图7 籽粒苋各器官GH含量

2.3 内源激素比值与籽粒苋各器官的关系

内源激素比值与籽粒苋各器官关系如图8所示.由图8可知，各激素比值除ABA/GH 最高为茎尖外，其他几组比值皆是胚根最高；ABA/GA，ZT/GA 和CTK/GA 都是茎尖最低；ABA/GH，ZT/GH 和CTK/GH 都是胚轴最低.这也从另一个侧面证明，茎尖旺盛生长能进行芽的分化与其有超高浓度的GA 有关，胚根尽管也生长旺盛，但不进行芽的分化，各激素比值都与茎尖相反.

图8 内源激素比值与籽粒苋各器官关系

3 讨论

植物内源激素提取方法较多，多在比较单一提取方式下研究参试因子之间相互关系，本研究中涉及提取方法相互间比较的研究还未见报道.鲜材料制备激素检测效果好，可能与激素易对环境条件产生反应、性质不稳定有关；添加助研物的检测效果要优于不添加助研物，其原因是助研物使细胞研磨更充分，有利于内源激素的释放；玻璃匀浆器研磨检测效果劣于直接研磨，其原因可能是研磨过程中产热，玻璃匀浆器没有研钵易于散发；粗提液要优于固相萃取与液相萃取，其原因可能是固相、液相萃取过程繁琐，损失所致.

植物各分化器官的形成是内源激素调控的结果［19］.茎尖ZT 含量最多可能与其进行芽的分化有关，而胚轴不进行芽分化故而含量较少.子叶与胚根虽然也不进行芽的分化，但生长方向纵横，类似芽分化，故而含量多于胚轴少于茎尖.ABA 的生理功能是能引起芽休眠、叶子脱落和抑制细胞生长等［20］.茎尖ABA 含量过多可能发挥其抑制细胞生长作用，以利于代谢物质累积，一旦其作用被GA 拮抗，则促进芽的分化.GA的主要作用是促进细胞伸长、分裂，侧芽休眠，茎尖含量最多，与其生长速度高于其他器官的特性相一致；从生长速度来看，子叶的生长速度要高于胚轴、胚根，所以子叶GA 含量也高于胚轴、胚根.CTK 的生理作用主要是引起细胞分裂，诱导芽的形成和促进芽的生长.茎尖CTK 含量最高与其进行芽的分化生长特性相吻合.GH有促进细胞分裂，抑制花朵脱落和侧芽生长与叶片衰老的能力，这与茎尖旺盛生长具有顶端优势特性相符合.子叶生长较旺盛，胚轴、胚根长势低于子叶、茎尖，所以子叶GH 含量低于茎尖，高于胚轴、胚根.

植物各器官的分化与内源激素比值相关.CTK/GH比值高，有利于促进芽的分化，比值低有利于根的分化［21］.本研究所得各激素比值中胚根、茎尖处于两个极端最多.除ABA/GH外，以ABA，ZT，CTK为分子的比值都是胚根高，说明植物在根系生长过程中，虽然这几个激素需要量少，但比值要高，这与未晓巍［22］的研究结果根中ABA 含量多于叶中相一致；GA 做分母的几个比值都是茎尖最低，说明植物在进行芽分化过程中需要高浓度的GA.

4 结论

本实验结果表明用石英砂研磨破碎籽粒苋鲜材料细胞后制备粗提液的ELISA 检测效果最佳.本方法优于-80 ℃处理鲜材料或40 ℃烘干鲜材料，也优于用研钵研磨或玻璃匀浆器研磨后的固相萃取或液相萃取方法.用最佳方法测定14 d籽粒苋无菌苗胚根、胚轴、子叶与茎尖的各激素含量，茎尖各激素含量最多，胚轴的ABA，CTK 与GH 含量最少，子叶激素含量都高于胚轴.籽粒苋各器官内源激素ABA，CTK与GH 的含量从高到低顺序都是茎尖、子叶、胚根与胚轴；各器官内源激素中GA 相差倍数较大、CTK 和GH相差倍数都较小；用GA做分母的各激素比值都是茎尖最低.

通过本研究，推测对籽粒苋进行离体培养时，培养基中适量添加GA 要好于不添加，说明植物在进行芽分化过程中需要高浓度的GA.