丝绵木果油的超临界提取及其油脂组成

朱诚炎，李 磊，纪祖阳，王 雷，王翼南，周梦琳，李舒宇，王宝琴

（滨州学院生物与环境工程学院，山东 滨州 256600）

丝 绵 木（Euonymus bungeanusMaxim.）又 名E.maackiiRupr.，无患子目、卫矛科、卫矛属小乔木，俗称白杜、桃叶卫矛、明开夜合。丝绵木的枝叶秀丽，果实红色，是良好的园林绿化观赏树种，广泛分布于中国境内除陕西、西南和两广外的其他各省区。

丝绵木种子中含有木栓酮、木栓醇、蒲公英萜酮、鲨烯、β-谷甾醇、长叶艾菊烯、棕榈酸等成分，还含有对人体有益的氨基酸，有机锗、有机硒的含量也较高。其粗提物主要为倍半萜类成分，具有较好的杀虫和拒食作用[1-2]。丝绵木种子的水提醇沉物还具有一定的降低SD大鼠血糖的作用[3]。丝绵木叶的乙酸乙酯和正丁醇提取物，具有良好的抗氧化作用和护肝保肝作用，其护肝作用与其含有的总黄酮相关[4]。丝绵木种子的果肉中含有类胡萝卜素类黄色素，其乙酸乙酯或乙醇提取物也具有一定的抗氧化活性，同时该色素还具有较好的耐热性[5]。另外，在丝绵木的果实中还含有大量可用乙醇提取的生物碱和皂苷等活性成分，其总皂苷对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等均有抑制作用，其中对革兰氏阴性细菌枯草芽孢杆菌和沙门氏菌的抑制作用尤为明显。同时，该总皂苷对人肝癌细胞系SMMC、人宫颈癌细胞系HeLa和乳腺癌细胞系MCF7的生长有明显的抑制作用，对正常细胞的生长没有明显影响[6]。目前，对丝绵木的研究报道，主要集中在育苗及园林栽培技术等方面[7-8]，在生物活性物质方面，尚未检索到有对其果实和种子油脂方面的系统研究。本研究旨在考察绵木果实中油脂的分布特点，通过超临界CO2提取工艺和GC-MS联用方法，分析其脂肪酸组成和化学成分。

1 材料与方法

1.1 材料

丝绵木果实和种子采自山东省博兴益丰生态林场。

1.2 仪器设备

SFE-700S-2000R型超临界CO2萃取装置，7890A/5975C 型气-质联用仪，DHS16-A红外水分测定仪，DL-6M大容量冷冻离心机，250型索氏提取器，恒温水浴锅，电热培养箱，分析天平等。

1.3 试剂

正己烷、甲醇、氢氧化钾、无水乙醇、无水乙醚、无水硫酸钠等（均为分析纯），磷酸脂酶，95%氢氧化钠（食品级）。

1.4 实验方法

1.4.1 丝绵木果实油脂的分布

将丝绵木果分为果皮、种子、果实3种样品，于60℃下通风干燥4h，粉碎，索氏提取法[9]测定油脂。每种样品进行索氏提取3次，取其平均值。

1.4.2 丝绵木种子的超临界提取

1）丝绵木种子超临界CO2提取的影响因素实验：参考文献[10]的相关方法，丝绵木种子的超临界萃取过程采用一次加料、一级萃取、二级分离的方式进行，对萃取率影响较大的参数包括萃取压力、萃取温度、萃取时间等。每个因素设置5个梯度，重复3次，通过各因素萃取的油脂得率，确定最佳参数条件。

2）丝绵木种子超临界CO2提取的正交实验：根据影响因素的实验结果，对萃取压力、萃取温度和萃取时间等因素设置3个水平，进行L9(3)3正交实验，探讨最优萃取条件组合。

1.4.3 粗油脂的纯化

粗油脂按照如下工艺流程进行精制和纯化：酶法脱胶→碱法皂化脱酸→水洗→脱水。具体工艺过程如下：

脱胶（除磷脂）：取200mL粗油脂（毛油），加入0.05%磷酸脂酶（1200IU）10mL，用磁力搅拌器搅拌10 min 后，6000r·min-1离心 20min，收集上清液，弃去沉淀物。

脱酸（去除游离脂肪酸）：在脱胶油脂中加入适量95%的氢氧化钠（油脂总量的2%），充分搅拌20min 后，6000r·min-1离心 20min，收集上清液，弃去沉淀物。

上清液加入适量纯净水（油脂总量的5%），充分搅拌、静置后，用分液漏斗分离，去除水分。

油脂中加入10%的无水硫酸钠，充分搅拌，6000r·min-1离心20min，分别收集上清液和沉淀物，上清液即为纯化油脂。

1.4.4 碱甲酯化处理油脂

参考文献[11]中的方法，称取制备的纯化油脂样品约0.2g于10mL具塞试管中，加入1mL乙醚-正己烷（2∶1）混合溶剂溶解，再依次加入1mL甲醇、2%（W/V）KOH-甲醇溶液2mL，摇匀，于60℃水浴中加热10min后取出，冷却至室温。加入正己烷至刻度，混匀，振荡萃取，静置分层，取上层溶液定容至10 mL，即得甲酯化处理的油脂样品。

1.4.5 不皂化物的提取制备

称取5g丝绵木种子油脂样品，溶于装有50mL KOH-乙醇溶液（1.0mol·L-1）的250mL烧瓶中，沸水浴回流皂化1h左右至溶液澄清。冷却至室温，加50mL水，再用50mL正己烷萃取3次。合并萃取液，用90%的乙醇溶液25mL洗涤至中性，滤出溶液，真空蒸干，烘干至恒重，计算油脂中不皂化物含量。

1.4.6 GC-MS分析丝绵木果油脂的成分

利用GC-MS联用技术对甲酯化丝绵木果的油脂成分进行分析，用GC面积归一化法计算各组分的相对百分含量[12]。油脂样品用正己烷溶解后，在以下条件下进行GC-MS分析：HP-5MS石英毛细管柱（30 m×250μm×0.25μm）；载气为氦气，流速1mL·min-1，进样口温度250℃，传输线温度320℃。轰击源电子能量70eV，离子源温度为230℃，四极杆温度150℃。

升温程序：初始温度50℃，保持1min，20℃·min-1的速率升温到190℃，4℃·min-1升温到240℃，10℃·min-1升温到280℃，保持2min。样品进样量1 μL，不分流方式进样，全扫描(Scan)方式进行扫描。测定结果通过HP MSD CHEM Station化学工作站检索NIST98.L标准质谱图库，并对色谱峰中显示出的主要成分进行归类计算。

1.4.7 GC-MS分析丝绵木不皂化物的成分

检测条件：HP-5MS分析柱，进样量3 μL，分流比50∶1，进样温度300℃，离子源温度230℃。升温程序：初始温度70℃，保持2 min，8℃·min-1升温至250℃，保持5 min，10℃·min-1上升到300℃，保持8 min。定量分析以豆甾醇作为标准品，绘制标准曲线，根据峰面积比值计算相对含量。

2 结果与分析

2.1 丝绵木果油脂的分布

丝绵木果实中，果皮、种子和全果实各部位的油脂分布情况见表1。以丝绵木果实中的含油率为100%计，种子的含油量占果实总含油量的70.09%，为果实含油的主要部位。果皮虽然含油率高于全果，但其重量仅占果实干重的29.91%，即丝绵木的油脂主要分布在种子的籽仁中，含油率达43.79%，后续实验以种子为材料。

表1 丝绵木果油脂的分布

2.2 丝绵木种子油脂超临界提取的影响因素实验

2.2.1 萃取压力的影响

根据文献，20～35 MPa是较为合适的提取压力，大规模生产的提取压力为25MPa甚至更低[13-14]。为得到最高的萃取率，本实验在温度25℃、萃取时间2h的条件下，测定了20～40MPa范围内丝绵木种子油脂的提取率情况，结果见图1。压力为35MPa时，丝绵木种子油脂的萃取率最高，为36.17%。

图1 萃取压力对油脂萃取率影响

2.2.2 萃取温度的影响

如图2所示，适宜提取温度为30～40℃。在萃取时间2h、萃取压力30MPa的条件下，萃取温度为30℃时，丝绵木种子油脂的萃取率最高，为34.36%。

图2 萃取温度对油脂萃取率影响

2.2.3 萃取时间的影响

由图3可知，萃取温度为25℃、萃取压力30MPa时，随萃取时间的延长，萃取率呈增加的趋势，萃取时间为2h时，萃取率趋于平缓，故选择2h为最佳萃取时间。此条件下的种子油脂萃取率为39.18%。

图3 萃取压力对油脂萃取率影响

2.3 正交实验优化超临界CO2萃取法的提取工艺

根据单因素实验确定的最佳参数，以压力35MPa、温度30℃、萃取时间2h为最佳水平，前后各设置一个水平，设计了三因素三水平L9（33）正交实验（表2），按正交实验条件进行9次实验，根据萃取率数据，确定最大的影响因素和实验条件的最佳组合。

表2 丝绵木种子油脂萃取的正交实验因素表

由表3 可知，压力、温度、萃取时间这3个参数中，极差最大的是萃取时间，为11.23，最小的是温度，为3.32，因此，对丝绵木种子油脂萃取率的影响顺序为：萃取时间＞压力＞温度。由极差分析结果可知，3个参数的最佳组合为A3B2C2，即压力40MPa，温度 30℃，萃取时间 2h。

表3 丝绵木种子油脂萃取正交实验结果

2.4 最优工艺条件的验证

采用2.3中确定的最佳参数条件即压力40 MPa，温度30℃，萃取时间2h，对800g丝绵木种子进行超临界提取，所得油脂为338.4g，相对于种子含油率42.3%，即种子油脂的提取率为96.6%。

2.5 粗油脂的纯化

将超临界CO2提取的200mL粗油脂进行脱胶、脱酸、水洗、脱水等处理，共获得188.6g纯化油脂，得率为94.3%。

2.6 不皂化物的提取制备

5g种子油脂样品经KOH-乙醇溶液皂化后，用正己烷对不皂化物进行萃取，乙醇进行洗涤，干燥后得到不皂化物0.0275g，得率为0.55%。

2.7 GC-MS分析丝绵木果油脂的成分

采用GC-MS联用法对丝绵木种子油脂进行分析，其脂肪酸组成见表4。由表4和图4可知，丝绵木油脂的脂肪酸组成主要为：棕榈酸12.545%、亚油酸25.215%、油酸59.830%、硬脂酸2.410%，其中不饱和脂肪酸以油酸和亚油酸为主，达85.045%，属于高单不饱和脂肪酸油类。

表4 丝绵木种子油脂脂肪酸组成

图4 丝绵木油脂的GC-MS分析图谱

2.8 丝绵木不皂化物的成分分析

采用GC-MS分析丝绵木种子油脂中的不皂化物，结果见表5。由表5和图5可知，丝绵木种子油脂中的不皂化物主要以甾醇为主，包含有谷甾醇、豆甾醇和羊毛甾醇酯，总含量达2.259%，是一种富含甾醇的油脂，此外还含有数量可观的角鲨烯。

图5 丝绵木油脂中不皂化物的GC-MS分析图谱

表5 丝绵木种子油脂不皂化物组成

3 结论

本研究中，丝绵木种子油脂的超临界CO2提取工艺的最佳参数为：压力40MPa，温度30℃，萃取时间2h，此工艺适用于小批量样品的提取。蔡艳[13]和汪昌国[14]报道的植物油脂的大规模提取压力为25MPa甚至更低，在大规模提取时，要在提取得率和能耗之间进行权衡。从本研究的GC-MS分析结果可知，丝绵木种子油脂的脂肪酸组成主要为：棕榈酸12.545%、亚油酸25.215%、油酸59.83%、硬脂酸2.41%，其中不饱和脂肪酸以油酸和亚油酸为主，达85.045%，属于高单不饱和脂肪酸油类（high mono-unsaturated fatty acid，MUFA）。MUFA有明显的降低胆固醇作用，其降低血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇方面的能力与多不饱和脂肪酸（PUFA)相同[15-16]。刘根生等人[17]报道，MUFA能够正向调节血脂代谢，降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL)的氧化敏感性，保护血管内皮和降低血液高凝状态。另外，含高单不饱和脂肪酸的特殊类型肠内营养制剂能够降低Ⅱ型糖尿病患者的血糖水平，尤其对餐后血糖水平的降低更加明显，在临床上比标准配方的营养制剂更适合于糖尿病患者的营养需求[18]。因此，丝绵木种子中的MUFA具有开发前景。

本研究中，丝绵木种子油脂中的不皂化物以甾醇为主，包含有谷甾醇、豆甾醇和羊毛甾醇酯，总含量达2.259%，是一种富含甾醇的油脂，此外，还含有数量可观的角鲨烯。丝绵木种子油脂中含有较高水平的植物甾醇，尤其是谷甾醇含量高于普通植物油脂的平均含量。研究证明，植物甾醇和植物固烷醇对降低血液胆固醇水平有一定的效果[19-20]。此外，植物甾醇还有抗炎、退热、美容、抗癌、促进动物生长等生理功效。植物甾醇在减肥和抗氧化两方面有重要作用[21]。丝绵木在我国的种植范围广，果实产量高，综合开发并利用丝绵木种子的油脂资源，在生物柴油、医药健康产品和饲料添加剂等方面将具有广阔的前景。