解淀粉芽胞杆菌TR2对草莓土壤酶活性的影响与防病促生作用

赵雨萌，缪佩佩，王旭东，高坦坦，史晓艺，贾绍雷，任争光，赵晓燕

（北京农学院生物与资源环境学院/农业农村部华北都市农业重点实验室，北京 102206）

草莓原产于南美洲，在世界范围内广泛种植，草莓果实味道鲜美、营养丰富，深受百姓喜爱。中国是世界上草莓生产大国之一，自1994年起产量始终居于世界第一，占全世界总产量的1/3[1]。随着草莓种植产业的发展，草莓病害频频发生，如草莓根腐病、草莓白粉病、草莓炭疽病等，草莓的产量和品质受到不同程度的影响[2]。正确运用化学防治、农业防治、生物防治等技术，能够有效预防和控制病害的发生[3]。试验报道，枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis按 4050 g/hm2用量单独使用，对草莓白粉病的防治效果达92.09%[4]。贝莱斯芽胞杆菌B. velezensisZZBV-3可有效防治草莓根腐病，盆栽防治效果可达 77.96%和81.18%[5]。以生防菌为产品的生物防治已经成为备受关注且有明显效果的技术之一[6]。

解淀粉芽胞杆菌B. amyloliquefaciens作为一种被广泛应用的生防菌，具有抑菌谱广、防病效果好等特点[7]，解淀粉芽胞杆菌能够分泌多种酶类如蛋白酶、几丁质酶等，也能分泌一些抗菌肽等抑菌物质，可以拮抗多种病原物[8]。同时，解淀粉芽胞杆菌产生的次生代谢产物不仅能够影响土壤中微生物的种群结构，促进根际微生物趋向有利生长的方向转变，还能够改善土壤酶活性，增强土壤肥力，有利于土壤环境的健康发展[9]。

良好的土壤环境条件能够促进植物的生长和发育，是植物生存发育的物质基础，也是整个生态系统的枢纽[10]。土壤酶参与各种养分的合成和释放、有机质的循环利用以及不同方向的生理生化反应过程，土壤酶活性的高低直接影响土壤肥力的大小和土壤微生态环境，进而影响植物的生长发育[11]。

为了探究解淀粉芽胞杆菌对土壤酶活性的影响以及对草莓的防病促生作用，本试验通过解淀粉芽胞杆菌TR2对草莓的田间灌根处理，在不同时期采集土壤进行酶活测定，监测酶活的变化趋势和差异，同时对草莓根长、根重、叶面积、新叶数和果实数量、最大单果重等生长相关数据进行测量，调查生长阶段草莓根腐病的发生率，为阐明生防解淀粉芽胞杆菌对土壤酶活性的影响及其防病促生作用机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciensTR2由北京农学院植物病理实验室保存。

草莓品种：红颜；栽培方式：温室起垄栽培。

LA（固体）培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，琼脂15 g，水1000 mL。

LB（液体）培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，水1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 生防菌的发酵 取出-80 ℃冰箱中保存的解淀粉芽胞杆菌TR2，在LA平板上进行划线分离活化，37 ℃恒温培养箱培养过夜。取活化后的TR2单菌落在装有5 mL 液体LB培养基的试管中进行小量过夜摇培，温度37 ℃、转速220 r/min，然后按1:100的比例接种到装有100 mL LB液体培养基的500 mL三角瓶中进行大量摇培发酵，条件同前，发酵培养48 h，使菌液浓度达到2×108CFU/mL。

1.2.2 田间灌根处理 温室草莓定植一周（2020年9月18日）后，将发酵菌液稀释成60倍液进行灌根处理。温室为东西向起垄，共8垄，中间的6垄为试验区域（如图1所示），分为TR2处理区与对照处理区，每垄为一个重复，共6个重复，每个重复25株，处理之间间隔区为10株苗。每株灌根稀释后的菌液100 mL，对照组浇灌同样稀释60倍的LB培养基100 mL。在第7 d重复灌根一次加强处理。

图1 田间处理图示Fig. 1 The design of the field trial

1.2.3 样品采集 分别在第一次灌根后的第1、7、15、30、60 d进行样品采集，取样时每垄取两株草莓，包括植株与根系周围直径5 cm范围，深至主根系末端的土壤，随后在4 ℃冰箱内妥善保存。

1.2.4 土壤酶活测定 试验共测定4种草莓土壤酶活性，其中土壤脲酶活性测定采用苯酚纳比色法，土壤过氧化氢酶活性测定采用高锰酸钾滴定法，土壤蔗糖酶进行活性测定采用3,5-二硝基水杨酸比色法，土壤磷酸性酶活性测定采用磷酸苯二钠比色法，分为酸性磷酸酶和碱性磷酸酶两种活性[12-14]。

1.2.5 草莓生长指标测定 充分清洗植株根系后，测量草莓的根长、根重、叶面积和新叶数（指除移栽前的老叶之外的叶片）等相关生长数据。

草莓叶面积采用吐德拉草莓叶面积法进行估算，取每个植株最大的叶片测量叶片宽度，计算公式[15]如下：叶面积y＝7.0918x－13.4784，x为叶宽，单位cm。

待果实成熟后（定植后90 d）采收，记录单株草莓中已成熟的果实数量，并利用电子天平称量单株草莓的最大单果重量。

1.2.6 草莓根腐病发病率和防效调查 在第一次施药后第7、15、30和60 d时调查田间TR2处理区和对照区草莓根腐病的发病情况，统计草莓死苗数量计算发病率，并计算解淀粉芽胞杆菌TR2对草莓根腐病的防治效果。死苗率（%）＝死苗株数/总调查株数×100，防效（%）＝（对照死苗率－处理死苗率）/对照死苗率×100。

1.3 数据统计与分析

采用Excel 2007和SPSS 17.0软件进行数据分析，应用ANOVA单因素（LSD法）进行TR2处理组和对照组的差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 解淀粉芽胞杆菌TR2对土壤酶活性的影响

解淀粉芽胞杆菌TR2处理对草莓土壤酶活性的影响如图2所示，在60 d的试验过程中，土壤的各种酶活性都呈上升的趋势，包括脲酶、过氧化氢酶、蔗糖酶、磷酸酶等，而且TR2处理的土壤酶活高于对照，说明解淀粉芽胞杆菌TR2处理对草莓土壤的4种酶活性都有促进作用。

图2 解淀粉芽胞杆菌TR2对土壤酶活性的影响Fig. 2 Effect ofBacillus amyloliquefaciensTR2 on soil enzyme activity

解淀粉芽胞杆菌TR2处理对草莓土壤脲酶活性和蔗糖酶活性的促进作用较好。其中对脲酶的促进作用表现最早且延续时间长，在第7、15、30和60 d，TR2处理的草莓土壤脲酶活性与对照有显著差异，比对照分别高出148%、44%、215%和39%，其中第30 d时的促进作用最好（图2A）。解淀粉芽胞杆菌TR2处理从第15 d开始表现对草莓土壤蔗糖酶活性的明显促进作用，在第15、30和60 d，TR2处理的草莓土壤蔗糖酶活性比对照分别高出33%、124%和44%，差异显著，其中第30 d时的促进作用最好（图2B）。

解淀粉芽胞杆菌TR2处理对草莓土壤过氧化氢酶活性的促进作用表现比较晚，从第30 d开始处理与对照的差异具有显著性，第30 d和第60 d比对照组分别高出38%和43%，其中在第60 d时的促进作用最好（图2C）。

土壤磷酸酶分酸性磷酸酶和碱性磷酸酶两种形式，在第15 d和第60 d时，解淀粉芽胞杆菌TR2处理对草莓两种土壤磷酸酶活性的促进作用具有显著性。在第15 d时，TR2处理的土壤酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性分别比对照高出69%和45%；在第60 d时，TR2处理的土壤酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性分别比对照高出27%和49%。综合来看，TR2处理在第15 d时对土壤磷酸酶的促进作用最好（图2D）。

2.2 解淀粉芽胞杆菌TR2对草莓生长的影响

解淀粉芽胞杆菌TR2对草莓生长的影响如图3和表1所示，在60 d的试验过程中，处理组草莓的各种生长指标都大于对照组，包括草莓根长、根重、草莓新叶数和最大叶面积，草莓的单株成熟果实数量和最大单果重量等，说明解淀粉芽胞杆菌TR2对草莓的生长具有促进作用。

图3 解淀粉芽胞杆菌TR2对草莓植株生长的影响Fig. 3 Effect ofBacillus amyloliquefaciensTR2 on strawberry growth

表1 解淀粉芽胞杆菌TR2对草莓果实生长的影响Table 1 Effect ofB.amyloliquefaciensTR2 on strawberry fruit growth

在定植后90 d试验调查时，单株成熟果实数与最大单果重都与对照有显著差异，处理组单株的成熟果实平均比对照多将近4个，平均最大单果重是对照的两倍（表1），说明解淀粉芽胞杆菌TR2能够有效促进果实的成熟，提前果实的成熟时间，也能够有效增加果实的重量。

解淀粉芽胞杆菌TR2处理从第7 d开始就表现对草莓根部生长的促进作用，第7、30、60 d的根长和7～60 d的根重都与对照有显著差异，对根长的促进作用在20%左右；对根重的促进作用更好，第60 d时，处理组根重比对照组高出92%。解淀粉芽胞杆菌TR2处理对地上部分生长的促进作用从第15 d以后开始显现，第15 d和第30 d的最大叶面积和新叶数都与对照有显著差异，15 d时平均最大叶面积比对照大10 cm2，第30 d时平均每株比对照多长出1.2个新叶。

2.3 解淀粉芽胞杆菌TR2对草莓根腐病的防病作用

在试验过程中，田间草莓根腐病的发生率在20%以内，解淀粉芽胞杆菌TR2处理组草莓根腐病的发病率始终低于对照组，在15～60 d处理组的死苗率与对照组都有显著差异，防效在25%左右（表2）。说明解淀粉芽胞杆菌TR2灌根处理可以减少草莓根腐病的发生，具有较好的防病作用。

表2 解淀粉芽胞杆菌TR2对草莓根腐病的防病作用Table 2 Control effect ofB.amyloliquefaciensTR2 on strawberry root rot

3 讨论

土壤酶活性是土壤的重要理化指标，一般认为，土壤环境中土壤酶的活性程度越高，土壤肥力越高[16,17]。本研究结果表明，解淀粉芽胞杆菌TR2处理后对草莓根际周围土壤的脲酶、淀粉酶、过氧化氢酶及磷酸酶等4种酶活性均具有促进作用，同时表现出对根长、根重、叶片生长以及果实生长与成熟的促进作用，说明解淀粉芽胞杆菌TR2的促生作用可能与其能够提高土壤酶活性，从而提高了土壤的肥力有关。

土壤酶活性与土壤中的氮素循环、碳素循环、微生物的量及活性密切相关[18-21]。本研究结果表明，解淀粉芽胞杆菌TR2从第7 d开始就陆续对脲酶、淀粉酶、过氧化氢酶及磷酸酶等4种酶活性表现明显促进作用，并且到第60 d时仍然对4种酶活性具有明显的促进作用，促进作用的持续时间较长。赵艳等[22]研究表明施用胶质芽胞杆菌菌剂对黑麦草根际土壤脲酶、磷酸酶及过氧化氢酶活性在苗期、中期和收获期均高于对照，也表现出比较长期的促进作用。而高吉坤等[23]研究的枯草芽胞杆菌B29对黄瓜根际土壤脲酶、过氧化氢酶、蔗糖酶和磷酸酶活性的促进作用仅在0～20 d期间内比较明显，到第30 d或40 d时与对照没有明显差异。由此可见，生防菌的施用能有利于土壤酶活性的提高，但是不同菌株对土壤酶活的促进能力不同。

解淀粉芽胞杆菌TR2是一株对多种病原菌具有抑菌活性的菌株，前期研究表明该菌株能够减轻西瓜枯萎病的发生，并且具有较好的解磷解钾能力[24]；本研究进一步证明了该菌株可以促进草莓土壤的酶活性和草莓的生长，减少田间草莓根腐病的发生，因此该菌株是一株具有良好潜力的土传病害生防菌株，具有较好的应用前景。一般认为，生防菌对植物病害的防病机制主要有拮抗作用、促生作用、诱导抗性作用以及对微生物群落结构的调控作用[25]。本研究虽然明确了解淀粉芽胞杆菌TR2对土壤酶活性的促进作用，但对于与土壤酶活性密切相关的土壤中微生物的量与群落结构的变化，以及之间的关系并不清楚。因此，继续开展该菌株在草莓根际的定殖动态以及对微生物群落结构调控作用的研究，进一步明确该菌株的生防机制，为更好地开发和应用该菌株打下基础。