对韭菜迟眼蕈蚊高活性的苏云金芽胞杆菌JQD117发酵培养基及摇瓶发酵条件优化

宋 健，张海剑，丰 硕，程佳旭，柳健虎，郭玮冰，曹伟平

（河北省农林科学院植物保护研究所/河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心/农业农村部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室，保定 071000）

韭菜迟眼蕈蚊Bradysia odoriphagaYangetZhang属双翅目、长角亚目、眼蕈蚊科、迟眼蕈蚊属，幼虫俗称“韭蛆”。韭菜迟眼蕈蚊是我国特有的昆虫，目前国外尚无相关的报道[1]。它严重为害百合科、菊科、藜科、十字花科、葫芦科、伞形花科等7科30多种蔬菜的地下嫩茎、主根、地面附近的皮下组织等，对韭菜的为害最为严重[2-4]。目前生产上对韭菜迟眼蕈蚊的防治主要以化学防治为主[5]，由于韭菜是多年生宿根植物，长期大量使用化学农药，导致“毒韭菜”事件时有发生。随着高毒农药的禁用，寻找环境友好、安全有效的防治措施，成为防治韭菜迟眼蕈蚊急待解决的问题。

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）属革兰氏阳性细菌，在生长代谢过程中，能够在芽胞中形成伴胞晶体，也称为杀虫晶体蛋白（insectidal crystal proteins，ICPs）或δ-内毒素[6]。Bt主要是经过虫口进行感染，通过杀虫蛋白晶体杀死昆虫，一般认为其杀虫作用过程要经过溶解、酶解活化、与受体结合、插入以及孔洞或离子通道的形成等环节[7]，最后导致幼虫麻痹死亡或引起败血症死亡[8]。据报道，Bt还具有抑制作用的杀菌蛋白或多肽[9]，如BtentomocidusHD110 产生的Entomocin 110能够有效的抑制单增李斯特菌Listeria monocytogenes[10]。Bt对环境友好，对人畜无害，目前已成为世界上产量最大的微生物农药，被广泛用于防治农业、森林、果树等害虫防治中[11-13]。

虽然苏云金芽胞杆菌的发酵培养对营养物质的要求不高[14]，但不同的Bt菌株所需营养条件不尽相同，不能使用某一特定配方作为所有Bt菌株的发酵培养基[15-17]。因此，进行 Bt 菌株发酵培养基组分和发酵条件的选择和配比优化对提高菌株发酵产量极其重要。

Bt菌株JQD117是本试验室前期筛选到的一种对韭蛆具有较强杀虫活性作用的菌株[18]，本研究采用单因素和响应面分析法，以发酵液中活芽胞含量作为评价指标，对该菌株的发酵培养基进行筛选与优化，以提高该菌株产生量，从而提高其杀韭蛆效率，为该菌株今后的工业化生产及其在农业生产上的应用提供初步指导。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

BtJQD117菌株保存于河北省农林科学院植物保护研究所微生物杀虫剂课题组。

1.2 Bt发酵培养基及摇瓶发酵条件优化

1.2.1 发酵培养基和发酵条件单因素爬坡试验 在初始培养条件（培养基：大豆饼粉 3.50%，棉籽饼粉1.50%，可溶性淀粉1.50%，酵母粉1.00%，CaCO30.20%，MnSO40.04%，MgSO40.02%，K2HPO40.05%；培养条件：30 ℃，接种量1%，250 mL三角瓶装液量100 mL，温度30 ℃，转速200 r/min，初始pH 7.0）的基础上，固定其他因子，对其中一个因子的量设梯度，进行振荡培养。采用平板菌落计数法计算活芽胞数。每个处理重复3次。

1.2.2 响应面试验设计及数据分析 在单因素爬坡试验的基础上，得到 13个因素的最佳值，以最佳值作为中心点，以Bt芽胞产量作为响应值，采用Box-Behnken Design（BBD）进行试验设计，每个因素取（-1，0，1）三个水平输入Design-Expert响应面分析软件设计13因素3水平响应面试验（表1）。分别按照试验安排进行振荡培养，采用平板菌落计数法计算活芽胞数，将试验数据进行数据分析，获得回归方程，最终确定因素的最佳组合。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.3 平板菌落计数法 根据稀释梯度计算每毫升发酵液中活菌数量。将被测样品用无菌蒸馏水稀释至10-7和10-8两个稀释梯度，将稀释后的待测样品定量均匀涂布到灭菌的细菌培养平板上，每个处理重复3次，30 ℃恒温培养箱培养24 h，进行菌落计数，并根据稀释倍数和取样量计算样品的活芽胞数[19]。

1.2.4 模型验证 用软件分析得出的最佳发酵培养基配方和最佳发酵条件进行4次平行验证试验，采用平板菌落计数法计算活芽胞数，取得平均值。与预测值进行比较以验证模型的可靠性，进而得出最终优化结果。

2 结果与分析

2.1 单因素爬坡试验结果

芽胞产量同培养基浓度和发酵条件的关系研究表明，Bt芽胞产量随着培养基浓度增加呈先增加后减少的趋势。发酵培养基各因素的最佳值：棉籽饼粉2.00%，大豆饼粉1.00%，酵母粉1.50%，可溶性淀粉2.00%，CaCO30.30%，MnSO40.04%，MgSO40.1%，K2HPO40.04%；Bt芽胞产量随着发酵条件的变化呈先增加后减少的趋势，发酵条件各因素的最佳值：接种量3%、装液量60 mL、温度30 ℃、转速150 r/min、初始pH 7.59（图1，2）。

图1 发酵培养基各成分不同浓度对Bt产芽胞量的影响Fig. 1 Effect of different concentration of components in fermentation medium on the number of Bt spores

图2 不同发酵条件对Bt产芽胞量的影响Fig. 2 Effect of different flask fermentation conditions on the number of Bt spores

2.2 响应面试验结果与分析

以芽胞产量为响应值，应用回归分析对方程和各因子进行方差分析（表2），结果表明回归方程显著性检测P＜0.0001，说明该方程模型属于极显著；失拟项P＞0.05，失拟项不显著；回归方程模型与实际试验拟合性较好，实验误差小，模型是可行的，数据是可信的，证明应用响应面法优化菌株Bt JQD117的发酵培养基及摇瓶发酵条件是可行的，具有参考性。各因素对 Bt芽胞产量的影响次序为：棉籽饼粉＞装样量＞K2HPO4＞转速＞大豆饼粉＞温度＞pH＞接种量＞MnSO4＞酵母粉＞CaCO3＞可溶性淀粉＞MgSO4。经回归拟合后，根据回归方程，考察拟合相应曲面的形状，通过分析碳源、氮源、无机盐和发酵条件等13个因素对产芽胞量的影响，发现棉籽饼粉与其他 12项因素交互作用均显著，其中，棉籽饼粉和装样量对Bt的产芽胞量影响最显著（等高线较其他因素的等高线陡峭），K2HPO4、转速和大豆饼粉次之（图3）。通过Design Expect 8.0软件分析确定最优点，当Bt芽胞产量最大时，可求得各因素水平：A＝1.5%，B＝3%，C＝2.94%，D＝0.5%，E＝0.496%，F＝0.021%，G＝0.035%，H＝0.215%，J＝30.85 ℃，K＝122.23 r/min，L＝30 mL，M＝7.93，N＝1.28%；进行编码转化后得到最佳固体发酵培养基成分为：大豆饼粉 1.5%，棉籽饼粉3%，可溶性淀粉2.94%，酵母粉0.5%，CaCO30.496%，MnSO40.021%，K2HPO40.035%，MgSO40.215%，最佳发酵条件为培养温度30.85 ℃，转速122.23 r/min，装量30 mL/250 mL三角瓶，起始pH 7.93，接种量1.28%。在此理论最佳发酵条件下，回归方程预测Bt JQD117理论芽胞产量可达到6.75×109芽胞/mL。

图3 二因素交互影响Bt产芽胞量等高线图Fig. 3 Contour chart of two factors interaction affects Bt spores

表2 响应面试验回归方程方差分析Table 2 Analysis of variance of regression equation in response surface test

续表2

续表2

2.3 模型验证结果

为了检验模型预测的可靠性，在上述理论最佳发酵条件下进行4次重复平行验证试验，发现Bt JQD117菌株实际芽胞产量平均值为5.97×109个/mL，与模型预测值6.75×109个/mL无显著差异。这证明了方程模型数据的可靠性，证明响应面分析法优化 Bt发酵培养基和发酵条件是有效的。相比于初始培养基的芽胞产量2.5×109个/mL，优化后的工艺发酵水平提高138.8%。

3 讨论

在微生物发酵生产过程中，发酵培养基的优化起着至关重要的作用，其不仅对发酵水平的提高有着举足轻重的作用，而且也是决定该微生物能否成功商业化的关键所在。由于微生物发酵过程是十分复杂、高度非线性和非结构化的，建立一个准确适合的模型指导其发酵过程存在着许多困难[20]。因而选择合理的试验设计和优化方法对培养基的优化十分关键。

响应面分析法是利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。相较于传统利用回归正交试验设计对菌株培养条件进行优化，不仅克服了后者不能排除交互作用混杂影响的缺点，而且同时对试验各单因子及其交互作用做评价，建立连续变量曲面模型，能快速准确地确定各发酵条件的最优值，相较于同类研究中的实验设计，对最优发酵条件筛选更加精确，优化后的发酵水平提升也更加明显。

Sumant等[21]利用响应面分析法对一株产碱性蛋白酶的芽胞杆菌发酵培养基进行优化，使其碱性蛋白酶产量提高了2.6倍。周虓等[22]将单因子优化与响应面结合，优化了产耐高温蛋白酶 Bt FZ62的发酵培养基，发酵水平比初始设计提高了3.22倍；郑毅等[23]将二水平Plackett-Burman设计与响应面相结合优化了产耐高温蛋白酶Bt FS140的发酵培养基，FS140最终发酵产酶水平达918.91 U/mL；杨梅等[24]应用上述方法对Bt LLB19的培养基进行了优化，较初始培养基芽胞产量提高了24.6%；陈宇熹等[15]应用此法优化了高效杀蚊Bt BRC-LLP29的发酵培养基；张群林等[25]采用此法优化了Bt BRC-ZQL3的发酵培养基，比初始发酵培养基产孢水平提高了60.66%；成飞雪等[16]采用此法优化了Bt YC-10的发酵培养基，比优化前提高了29.5%；李姝江等[26]利用响应面法优化贝莱斯芽胞杆菌ZJ20发酵参数，菌落数达769×107CFU/mL，比优化前提高了17.71倍。本试验利用单因素试验和响应面试验相结合的方法，优化出Bt JQD117菌株最佳培养基和发酵条件：大豆饼粉1.5%，棉籽饼粉3%，可溶性淀粉2.94%，酵母粉0.5%，CaCO30.496%，MnSO40.021%，K2HPO40.035%，MgSO40.215%；最佳发酵条件为培养温度30.85 ℃，转速122.23 r/min，装量30 mL/250 mL三角瓶，起始pH 7.93，接种量1.28 %。优化后发酵理论芽胞产量达到6.75×109个/mL，验证后实际为5.97×109个/mL，产生此情况的原因可能是由于发酵培养基在实际发酵过程中，随着细菌的生长和芽胞数量的逐渐增加，影响了发酵pH和氧气浓度变化，造成最终芽胞产量的变化，但两者无显著性差异。说明利用响应面分析法进行Bt菌株JQD117发酵培养基的优化是合理可靠的。优化后发酵水平相比于初始培养基的芽胞产量（2.5×109个/mL），提高了38.8 %。

目前，有关Bt培养优化方面的研究已有不少文献报道，基本都以发酵液中菌体浓度或活芽胞产量作为评价指标，本文在 Bt培养条件优化的研究中，也是以发酵液中活芽胞产量为评价指标来进行衡量的，该方法简便、快捷、易操作，同时 Bt菌株在发酵过程中芽胞的产生与晶体蛋白含量具有一定的相关性。因此在今后菌株的开发和生产中以及对该菌株在农业生产上的应用具有一定的指导作用。