新疆荒漠绿洲区越冬亚洲玉米螟病原真菌种类鉴定及多样性分析

蒋旭东，丁新华，王小武，付开赟，袁梓涵，吐尔逊·阿合买提，何 江，贾尊尊,，郭文超，王志方，杨新平，代金平，谢玉清，周留艳，冯 蕾

（1.新疆农业大学农学院，乌鲁木齐 830052； 2.新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物重点实验室，乌鲁木齐 830091；3.新疆农业科学院植物保护研究所/农业农村部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室，乌鲁木齐 830091）

昆虫病原真菌具有高效、低毒、低残留等特点，易引发昆虫的流行病，在玉米螟[1]、蚜虫[2]等害虫的生物防治中有非常重要的作用，是自然界中控制害虫种群消长的重要因子和生防资源[3-8]。有研究报道，不同生态环境由于生物与非生物因子不同，害虫病原真菌的种类与优势种有很大差异[9]，开展病原微生物种质资源及多样性研究，调查不同生境病原真菌分布、物种多样性及群落结构，对了解、开发本土生防菌资源和开发生物源制剂都具有非常重要的作用，因此收集和分离病原真菌对生物农药开发应用具有重要意义[10]。通过对病原真菌等主要生物致死因子的分析，掌握其对玉米螟等害虫种群数量调节能力，估计种群发展趋势，可为害虫综合防治及预测预报提供科学基础[7]。

玉米是新疆主要粮食作物之一。2019年新疆玉米种植面积99.72×104hm2，占全疆农作物面积的16.2%，占粮食作物面积的 45.7%，是当地种植业与畜牧业协调发展的重要支柱农作物[11]。亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis作为玉米上的主要害虫，一般发生年份玉米减产10%～20%，严重发生年份减产达50%以上，甚至绝产[12]，严重影响了新疆玉米产业的健康发展。新疆玉米生产属荒漠绿洲生态环境，关于该地区玉米螟病原真菌的资源分布与优势种还未见报道。因此，本团队2019—2020年连续2年在新疆5个地州6个县/市185个样点采集越冬亚洲玉米螟幼虫，分离鉴定玉米螟越冬幼虫感染病原真菌的种类，旨在了解新疆荒漠绿洲区越冬玉米螟病原真菌资源及物种多样性，为新疆玉米种植区的玉米螟的生物防治提供理论基础与病原真菌资源[13-15]。

1 材料与方法

1.1 越冬亚洲玉米螟幼虫采集

2019—2020年连续2年的4月，在新疆5个地州6个县/市185个样点采集越冬亚洲玉米螟幼虫，单头单管编号保存，共534号（份）（表1），带回实验室，罹病虫体单管保存于4 ℃冰箱，用于后续分离、鉴定等试验。

表1 亚洲玉米螟罹病虫体来源及寄主（新疆2019—2020）Table 1 Sources and hosts of diseased Ostrinia furnacalis (Xinjiang 2019—2020)

1.2 菌种分离、纯化与鉴定

菌株分离、纯化与鉴定参照陈名君等[8]的方法。罹病幼虫样品和分离菌株均保存于新疆农业科学院微生物应用研究所菌种保藏中心。

1.2.1 虫-菌分离 在超净工作台上，将采集到的长满菌丝的幼虫体挑取部分菌丝，接种到PDA培养基上进行分离培养；虫体浸入75%的酒精中，消毒5 s，再用无菌水漂洗3次，用灭菌滤纸吸净水分；用消毒后的解剖刀将虫体剖开，放入无菌水中混匀；再进行不同梯度浓度的稀释，均匀涂布于 PDA平板上。将平板放置于28 ℃恒温培养箱中培养，待平板表面菌丝覆盖一半的平板时，挑取单菌落进行分离、纯化（纯化后的菌株再转接到亚洲玉米螟2龄幼虫以验证是否为玉米螟病原菌）。

1.2.2 菌种鉴定 使用CTAB法提取菌株的基因组DNA，采用真菌通用引物ITS1和ITS4进行ITS序列扩增，将扩增产物测序（杰李生物技术（上海）股份有限公司）。将所得基因序列与GenBank数据库中保存的基因序列进行比对，得到与目的菌株具有同源性的多株菌株相应序列。从中选择下载同源性较高的序列，使用MEGA 10.0软件，运用NJ法进行1000次步长计算，构建系统发育进化树。

1.3 数据统计与分析

1.3.1 优势种的确定 依据相对分离频率（RF）来确定新疆亚洲玉米螟优势寄生真菌菌株：＞10%为优势种，1%～10%为常见种，＜1%为稀有种[16,17]。RF（%）＝ 样本中分离得到的某种（属）虫生真菌菌株数/分离得到总菌株数×100 。

1.3.2 Sorenson相似性系数（Cs）分析 Cs计算公式[18]：Cs＝2j/a＋b；其中，j 是玉米螟两个不同地理种群中共同具有的真菌种类数；a 是地理种群 A 中分离出真菌的种类数；b 是地理种群 B 中分离出真菌的种类数。

1.3.3 多样性指数 采用Excel 2016对原始数据进行相应分析。菌株和寄主的分布特征采用种的丰富度、多度和相对多度统计，并用Shannon-Wiener 指数（H′）、均匀度（E）、相对多度，进行计算分析[18-20]。具体公式：Shannon-Wiener 指数（H′），H′＝-∑PilnPi；均匀度（E），E＝H/lnS；相对多度＝某个种的株数/所有种的总株数×100%。其中 Pi＝Ni/N；Ni为第i种的个体数；N为群落中总的个数；均匀度公式中H为实测多样性值，S为物种数目。

2 结果与分析

2.1 分离到的亚洲玉米螟病原真菌

从534份样本中共分离得到136株真菌，检出率为26.2%。将分离到的菌株ITS 序列在GenBank数据库中进行BLAST比对，其与已报道的菌株序列的相似度为98.38%以上（表2）；基于rDNA ITS序列片段构建的系统发育进化树（图1）显示，分离纯化得到的菌株依次为球孢白僵菌B.bassiana（27株）、红绶曲霉Aspergillusnomius（30株）、渐狭蜡蚧菌Lecanicilliumattenuatum（9株）、波兰青霉菌Penicillium polonicum（4株）、雷斯青霉菌Penicilliumraistrickii（2株）、镰孢霉Fusariumsp.（18株）、花腐镰孢菌Fusariumanthophilum（13株）、腐皮镰孢菌Fusariumsolani（1株）、木贼镰孢菌Fusariumequiseti（5株）、层出镰孢菌Fusariumproliferatum（3株）、链格孢菌Alternariaalternate（7株）、Cladosporium perangustum（5株）、多头被孢霉Mortierellapolycephala（8株）、直立枝顶孢霉Acremoniumstrictum（4株）（表2）。

表2 越冬玉米螟虫体分离获得病原真菌信息（2019，2020年）Table 2 Information of pathogenic fungi isolated from overwintering O.furnacalis (2019, 2020)

从越冬玉米螟罹病虫体上已分离得到的14种真菌形成了6大分支：其球孢白僵菌与渐狭蜡蚧菌聚为一大支，各自又分为两小支，说明渐狭蜡蚧菌与球孢白僵菌的关系较近；直立枝顶孢霉A.strictum单独为一支，说明与其他菌种关系较远；腐皮镰孢菌F.solani、层出镰孢菌F.proliferatum、木贼镰孢菌F.equiseti、镰孢霉Fusariumsp.、花腐镰孢菌F.anthophilum聚为一大支，且相互之间聚在一起，ITS序列不能较好将其区分，说明它们之间亲源关系非常近，红绶曲霉菌A.nomius、雷斯青霉菌P.raistrickii和波兰青霉菌P.polonicum聚为一大支，与其他病原真菌种类的亲源关系较远；C.perangustum、多头被孢霉M.polycephala、链格孢菌A.alternata这几个各自为一大支，说明与其他菌亲缘关系较远（图1）。

图1 基于ITS序列构建的系统发育树（2019，2020年）Fig.1 Phylogenetic tree constructed based on ITS sequence (2019, 2020 )

2.2 亚洲玉米螟病原真菌组成及分布

对分离获得的病原真菌菌株分类地位统计结果表明，136株真菌分别隶属于曲霉目 Aspergillus等7个目，曲霉科Aspergillus等7科，曲霉属Aspergillus等9个属（表3）。其中红绶曲霉（22.06%）、球孢白僵菌（19.85%）、镰孢霉（13.24%）为优势种；花腐镰孢菌（9.56%）、波兰青霉菌（2.94%）、雷斯青霉菌（1.47%）、渐狭蜡蚧菌（6.62%）、木贼镰孢菌（3.68%）、层出镰孢菌（2.21%）、多头被孢霉（5.88%）、链格孢菌（5.15%）、直立枝顶孢霉（2.94%）、C.perangustum（3.68%）为常见种；腐皮镰孢菌（0.74%）为稀有种。在分布地域上，菌株种类最多的是伊犁州霍尔果斯市（30.30%）和喀什地区疏勒县（18.19%），乌鲁木齐市新市区次之（15.16%），伊犁州新源县最低（12.12%）。乌鲁木齐新市区分离出的菌株数最多（58株），昌吉州昌吉市（30株）、伊犁州霍尔果斯市（21株）次之，伊犁州新源县（6株）最低（表3，图2）。

图2 新疆不同玉米种植区玉米螟病原菌株数和种数（2019，2020年）Fig.2 The number of pathogenic strains and species of O.furnacalis in Xinjiang different corn growing areas（2019, 2020）

表3 新疆玉米种植区玉米螟病原真菌组成及分离频率（2019，2020年）Table 3 Composition and isolation frequency of pathogenic fungi of O.furnacalis in Xinjiang’s main corn producing area（2019, 2020）

续表3

病原真菌种类、相对多度及丰富度在地区间存在很大差异。乌鲁木齐市新市区昆虫病原真菌相对多度最大，为41.43%，物种丰富度为5；其次为昌吉州昌吉市，相对多度为21.43%，物种丰富度为4；伊犁州霍尔果斯市和喀什地区疏勒县相对多度分别为15%和11.43%，物种丰富度依次为10和6（图3）。

图3 新疆不同玉米种植区玉米螟病原菌相对多度和丰富度（2019，2020年）Fig.3 Relative abundance and richness of pathogens of O.furnacalis in Xinjiang corn planting area（2019, 2020）

2.3 新疆荒漠绿洲区越冬玉米螟病原真菌多样性

2.3.1 病原真菌群落多样性分析 较其他玉米种植区，伊犁州霍尔果斯市病原真菌多样性指数和均匀度均偏高，为2.1743和0.9443，昌吉州昌吉市最低，为1.1198和0.8077。乌鲁木齐市新市区（3，相对优势菌属的种数）、伊犁州霍尔果斯市（3）、塔城地区沙湾市（2）和喀什地区疏勒县（2）上述 4个玉米种植区其共有的相对优势菌属均为镰孢菌属Fusarium，表明镰孢菌属分布范围广，生态位宽度较大（表4，5）。

表4 新疆玉米种植区昆虫病原真菌丰富度（2019，2020年）Table 4 Entomopathogenic fungi richness in Xinjiang corn planting area（2019, 2020）

表5 新疆玉米种植区昆虫病原真菌种群多样性（2019，2020年）Table 5 Diversity of entomopathogenic fungi populations in Xinjiang corn planting area（2019, 2020）

2.3.2 病原真菌群落相似性 采用Sorenson相似性系数分析结果显示，昌吉州昌吉市与乌鲁木齐新市区、伊犁州新源县与昌吉州昌吉市及伊犁州霍尔果斯市与喀什地区疏勒县的病原真菌属中等相似，相似性系数为0.5≤Cs＜0.75，伊犁州新源县与乌鲁木齐新市区、喀什地区疏勒县与乌鲁木齐新市区、伊犁州新源县与塔城地区沙湾市、伊犁州霍尔果斯市与塔城地区沙湾市、喀什地区疏勒县与伊犁州新源县、伊犁州霍尔果斯市与伊犁州新源县属中等不相似，相似性系数为0.25≤Cs＜0.50，伊犁州霍尔果斯市与乌鲁木齐新市区、喀什地区疏勒县与昌吉州昌吉市、伊犁州霍尔果斯市与昌吉州昌吉市、喀什地区疏勒县与塔城地区沙湾市极不相似，相似性系数为0＜Cs＜0.25（表6）。

表6 新疆玉米种植区玉米螟病原真菌相似性系数（2019，2020年）Table 6 Similarity coefficient of pathogenic fungi of O.furnacalis in Xinjiang corn planting area（2019, 2020）

2.4 新疆荒漠绿洲区越冬玉米螟感染优势病原真菌致死率

2019年和2020年新疆荒漠绿洲区越冬玉米螟中优势病原真菌总的感染致死率依次为1.2%～35.1%、2.1%～39.9%，平均致死率分别为7.02%、6.65%；2019年乌鲁木齐新市区感染优势病原真菌致死率最高（28%），其次为喀什地区疏勒县（2.1%），而塔城地区沙湾市最低（1.2%），卡方检验表明各采集地区玉米螟感染优势病原真菌（球孢白僵菌属致死率：χ2＝14.7，P＜0.05；曲霉属致死率：χ2＝14.7，P＜0.05；镰刀菌属致死率：χ2＝14.6，P＜0.05）致死率差异性均显著。2020年乌鲁木齐新市区感染优势病原真菌致死率最高（14.6%），其次为昌吉州昌吉市（10.9%），伊犁州霍尔果斯市最低（1.6%），卡方检验表明各采集地区玉米螟感染球孢白僵菌属致死率差异性显著（χ2＝12.2，P＜0.05），而曲霉属（χ2＝2.7，P＞0.05）和镰刀菌属（χ2＝10.5，P＞0.05）无显著差异性（表7）。

表7 玉米螟感染优势病原真菌致死率及卡方检验表（2019，2020年）Table 7 O.furnacalis infection with dominant pathogenic fungi lethality and chi-square checklist (2019, 2020)

3 讨论

本研究于2019―2020年连续2年对新疆荒漠绿洲区罹病越冬玉米螟样本采集、分离，共获得136株病原真菌，属于7目7科9属14种，其中以红绶曲霉（22.06%）、球孢白僵菌（19.85%）、镰孢霉（13.24%）的数量占绝对优势，3种病原真菌的数量占所有菌株的55.15%。

已报道具有生防潜力的菌属为镰刀菌属、曲霉属、白僵菌属、蚧霉菌属、链格孢属和顶孢霉属[35]，在本文中占比依次为 29.41%、22.06%、19.85%、6.62%、5.15%和 2.94%。关于我国玉米产区玉米螟病原真菌资源调查已有报道，段小莉等[7]对我国玉米主产区的东北春玉米区、黄淮海夏玉米区、西南山地丘陵玉米区、西北内陆玉米区 14 个省、自治区亚洲玉米螟病原菌的寄生情况进行了调查。明确了球孢白僵菌是该虫的主要致死因子。本研究调查发现，除了白僵菌外，红绶曲霉、波兰青霉菌、雷斯青霉菌、渐狭蜡蚧菌等 12种菌在新疆玉米产区均有发现且上述菌均为第一次报道寄生亚洲玉米螟。而造成这一差异的原因可能与昆虫病原真菌的发生与环境温湿度及寄主有关，导致部分真菌零星分布/发生量少，调查难度增大，而球孢白僵菌属可寄生多种昆虫，分布广泛，容易调查[8,9]。

在自然环境中，病原真菌的分布与气候环境（雨量）、人为活动（外界干扰频次）、动植被丰富度、海拔高度以及历史环境变迁等有关[36,37]。本研究表明，伊犁州霍尔果斯市玉米种植区病原真菌种类较多，昌吉州昌吉市种类较为单一。造成这一差异的原因可能与气候条件（降雨多）[38]、人为活动少有关，昌吉州玉米种植区以种植玉米为主，整个生育期外界干预频次频繁，尤其是化学制剂使用频次高，导致病原真菌物种多样性较低[39]。而霍尔果斯玉米种植区，地处伊犁河谷（发展有机农业基地），整个生育期外界干预频次小（尤其是化学制剂使用频次低），加之雨量充沛[40]，适宜病原真菌生存。这一结果同刘玉军等[36]、王宏民等[37]、陈名君等[8]研究报道类似，其认为昆虫病原真菌多适宜生活在雨量多、气候条件优越、人为活动干扰少的地区。

本研究仅对新疆玉米产区越冬玉米螟病原真菌种类进行分离、鉴定及多样性分析，有关其致病力及与天敌、环境的相容性、玉米螟携菌与玉米茎腐病或穗腐病之间的关系还有待深入研究。此外，值得一提的是，室内科赫氏验证表明，本文涉及的镰刀菌属的真菌对玉米螟的致死率为25%～45%，镰刀菌属真菌虽对玉米螟有一定的致病性，但据文献报道，镰刀菌属大多亦为玉米病害（穗腐病）的病原真菌[41]，因此，关于镰刀菌属的真菌作为大田杀虫微生物，尤其是玉米田害虫的生物防治，还需深入研究和评价。