淡竹叶标准汤剂UPLC特征图谱研究

徐彤彤，林碧珊，刘 青，陈锦霞，肖炯昌，刘 勇，张文芳

(国药集团广东环球制药有限公司，广东 佛山 528303)

淡竹叶为禾本科植物淡竹叶LophatherumgracileBrongn.的干燥茎叶，一般在5-6月未开花前采割，晒干[1]。其主要化学成分包括黄酮类、三萜类、甾醇类、酚酸、氨基酸和糖类等[2-4]，具有清热、泻火、除烦的作用，是凉茶中经常会用到的一种药材。目前，《中华人民共和国药典》2020版(以下简称《中国药典》)中仅规定了淡竹叶药材总灰分和水分的限度，并没有规定特征图谱项，不能整体反映药材的质量信息。中药标准汤剂是以水为溶媒，在中医药理论的指导下，根据临床标准化汤剂煎煮方式制得的单味药水煎液。为了保证中药配方颗粒使用的安全性、有效性，标准汤剂起到参照物的作用，是评价中药配方颗粒是否与临床汤剂一致的基准[5-6]。因此，为了对中药配方颗粒进行全产业链质量控制，深入开展标准汤剂特征图谱的研究非常必要。淡竹叶饮片的炮制方法是除去杂质后切段，本实验将药材切段，按照标准汤剂制备方法煎煮，与标准汤剂进行比较，建立淡竹叶药材、标准汤剂UPLC 特征图谱，为淡竹叶中药配方颗粒的全过程控制提供参考[7-9]。

1 仪器与材料

1.1 仪器

H-class UPLC高效液相色谱仪(PDA二极管阵列检测器，Waters公司)；MS105DU和AL104型电子分析天平(梅特勒-托利多公司)；M-MILLIPORE Synergy UV 型超纯水制备仪(MILLIPORE公司)；KQ-500DE型超声清洗仪(昆山超声仪器有限公司)。

1.2 材料

异荭草苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：11974-201401)、日当药黄素对照品(成都德思特生物技术有限公司，批号：DST180202-050)；乙腈和磷酸为色谱纯；无水乙醇为分析纯；超纯水由MILLIPORE Synergy UV纯水仪制备。17批淡竹叶产地信息见表1，根据《中药配方颗粒质量控制与标准指定技术要求(征求意见稿)》制备淡竹叶标准汤剂冻干粉。

表1 淡竹叶产地信息

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱为Waters CORTECS T3 (2.1 mm×100 mm，1.6 μm)；乙腈为流动相A，0.1%磷酸水溶液为B，洗脱梯度：(0～2 min，10% A；2～3 min，10～16% A；3～7.5 min，16% A；7.5～16 min，16～52% A)；流速为0.25 mL/min；柱温为40 ℃；检测波长为350 nm；进样体积为1 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备 取异荭草苷对照品适量，精密称定，加60%乙醇制成每1 mL含10 μg异荭草苷的对照品溶液。

取日当药黄素对照品适量，精密称定，加60%乙醇制成每1 mL含10 μg日当药黄素对照品溶液。

2.2.2 淡竹叶药材(饮片)供试品溶液制备 取淡竹叶药材(饮片)细粉1 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加60%乙醇适量，超声处理(功率500 W，频率40 kHz)30 min，取出，放冷，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 淡竹叶标准汤剂供试品溶液制备 取相当于饮片1 g的淡竹叶冻干粉，精密称定，置50 mL量瓶中，加60%乙醇适量使溶解，超声处理(功率500 W，频率40 kHz)10 min，取出，放冷，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取“2.2.3”项下供试品溶液1份，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以峰2异荭草苷为参照峰，各共有峰所得相对保留时间的RSD值均小于0.3%，相对峰面积RSD值均小于1.0%，结果表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取“2.2.3”项下供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件进样测定。以峰2异荭草苷为参照峰，各共有峰所得相对保留时间的RSD值均小于0.3%，相对峰面积RSD值均小于2.0%，结果表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取“2.2.3”项下供试品溶液1份，按“2.1”项下色谱条件分别于0、4、8、12、16、20、24h进样，以峰2异荭草苷为参照峰，各共有峰所得相对保留时间的RSD值均小于0.4%，相对峰面积的RSD值均小于1.0%，结果表明供试品溶液24 h内稳定。

2.4 特征图谱的建立与分析

取17批淡竹叶药材(饮片)、标准汤剂，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。

将数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”，以平均数法，选择时间窗宽度为0.10，分别生成药材(饮片)和标准汤剂的特征图谱，并生成各自的对照特征图谱，结果见图1、图2，并以对照特征图谱为参照进行相似度评价。经对比分析确定淡竹叶标准汤剂有4个共有峰，发现淡竹叶药材(饮片)特征图谱与标准汤剂基本一致，有4个共有峰，分别与异荭草苷、日当药黄素对照溶液色谱图进行比对，确定峰2为异荭草苷、峰3为日当药黄素，结果见图3。生成的淡竹叶药材(饮片)、标准汤剂对照特征图谱，见图4。在17批样品图谱中，异荭草苷峰为多批次中的共有峰，较稳定且分离度良好，因此确定异荭草苷为参照峰，分别计算淡竹叶药材(饮片)及标准汤剂各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表2。

图1 17批淡竹叶药材(饮片)UPLC特征图谱

图2 17批淡竹叶标准汤剂UPLC特征图谱

表2 淡竹叶药材(饮片)、标准汤剂UPLC特征图谱分析

图3 淡竹叶标准汤剂供试品溶液与对照品溶液的UPLC色谱

2.5 相关性分析

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”，计算17批淡竹叶药材(饮片)、标准汤剂相似度，结果见表3。淡竹叶标准汤剂的4个共有特征峰在淡竹叶药材(饮片)中均有显示，表明在经过水提、固液分离、浓缩、干燥后制得的标准汤剂中没有新峰产生，也没有共有峰丢失，表明在制备过程中可追溯。17批药材(饮片)特征图谱与生成对照特征图谱相似度为0.876～0.996，标准汤剂特征图谱与生成对照特征图谱相似度为0.884～0.990，结果表明淡竹叶药材(饮片)与标准汤剂的化学成分基本一致，整体具有相似性，以峰2异荭草苷峰为参照峰，分别计算淡竹叶药材(饮片)和标准汤剂各共有峰的相对峰面积，结果发现相对峰面积值基本相符，各成分得到了有效的转移[10-11]，但不同批次共有峰相对峰面积的标准偏差值波动较大，药材(饮片)各共有峰相对峰面积的标准偏差大于39%，说明不同产地、不同批次药材质量参差不齐，各成分峰面积相差较大，这可能与产地、气候、运输、贮存条件等因素有关。

表3 17批淡竹叶药材(饮片)、标准汤剂相似度

图4 淡竹叶药材(饮片)(B)、标准汤剂(A)对照特征图谱

2.6 特征图谱的应用

淡竹叶在我国分布范围广泛，目前关于不同产地淡竹叶药材鉴别的研究文献较少，大多数研究都是通过性状鉴别区分淡竹叶与混伪品。通过研究不同产地淡竹叶药材特征图谱发现，其中一批药材按《中国药典》检验合格，制备成淡竹叶水煎液后测定特征图谱，发现峰4丢失，结果见图5。表明此方法可用于淡竹叶与混伪品的鉴别，能从药材源头上得到控制。

图5 淡竹叶与伪品色谱

3 讨论

本实验对梯度洗脱条件、检测波长、色谱柱、柱温、流速等系统适应性条件进行了考察，通过PAD检测器对供试品色谱在200～400 nm波长范围内进行光谱扫描，在350 nm波长下色谱图基线平稳，色谱峰信息较丰富，故选择350 nm作为该方法的检测波长。通过对供试品溶液制备方法进行考察，分别考察了提取溶剂(甲醇、50%甲醇、30%乙醇、60%乙醇、水)、提取方式(回流、超声)、提取时间(10 min、20 min、30 min)，结果表明在超声提取10 min、60%乙醇为溶剂时提取效果最佳。

淡竹叶标准汤剂的特征图谱与药材(饮片)特征图谱相似度较高，表明其化学成分基本一致，能够充分反映出从药材(饮片)到标准汤剂过程中化学成分可追溯。17批药材(饮片)、标准汤剂均有4个共有峰，其特征图谱相似度分别在0.876～0.996、0.884～0.990，化学成分相关性良好。传统饮片的服用方式一般为水煎服，通过特征图谱可以反映中药饮片到标准汤剂的传递性。本研究建立的超高效液相色谱法，大幅缩短了分析时间，降低了成本，提高了效率，通过特征图谱共有峰，可区分淡竹叶混伪品，也为其药材质量标准的制定提供了依据，为淡竹叶中药配方颗粒的全过程控制提供了方法。