分泌型酸性富含半胱氨酸样蛋白1型和整合素β1在致痫大鼠中的表达变化及相关性分析

劳基通 邝希 刘惠 肖敏 陈永敏 廖小平 马琳 李其富

癫痫是一种常见的中枢神经系统慢性疾病[1]，尤以颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy，TLE)最常见，其多与海马体区域的病变有关[2]。既往研究表明细胞外基质(extracellular matrix，ECM)和整合素受体在癫痫发生发展的过程中起重要作用[3-4]。分泌型酸性富含半胱氨酸样蛋白1型(secreted protein acidic and rich in cysteine1，SPARCL1)也称Hevin，是一种由星形胶质细胞分泌的突触蛋白，参与突触重塑过程[5]。既往研究表明，SPARCL1在癫痫发作后表达明显降低[6]。作为细胞外基质蛋白受体的膜蛋白整合素β1(Integrinβ1)也被证实，敲除Integrinβ1基因后能诱发癫痫持续状态(status epilepticus，SE)。然而，SPARCL1和Integrinβ1在癫痫发生发展过程中的具体分子机制尚未明确，因此本研究拟通过RT-qPCR和Western Blot方法检测SE后第1周内海马及邻近颞叶的皮层中SPARCL1和Integrinβ1的mRNA及蛋白水平表达变化，初步探讨两者在癫痫发生发展过程中的可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：选用鼠龄21 d雄性SD大鼠共56只，体重为60～80 g，购买于长沙市天勤生物技术有限公司，于室温20～25℃、湿度50%～70%SPF级环境饲养，每笼5只，12 h光照，自由进食和进水。

1.1.2主要试剂和仪器：硫酸阿托品(上海禾丰制药有限公司)和氯化锂-匹罗卡品(LiCl-PILO；购于美国Sigma公司)。兔抗SPARCL1抗体、兔抗Integrinβ1抗体、兔抗GAPDH抗体(内参抗体)、山羊抗兔IgG抗体(HRP)均购于中国博奥森生物有限公司。BCA蛋白质定量试剂盒购于中国Beyotime公司。TRIzol Reagent(Life)，HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)、ChamQ SYBR qPCR Master Mix(中国诺唯赞生物科技股份有限公司)，β-Actin基因作为内参基因，引物均由华大基因公司合成。SDS-PAGE蛋白电泳仪、转膜仪(美国Bio-Rad公司)，凝胶成像仪(中国天能公司)，荧光定量PCR仪MX3005P(中国安捷伦科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1LiCl-PILO急性大鼠模型的建立：56只大鼠随机分为致痫组(35只)和对照组(21只)。致痫组大鼠按体重127 mg/kg予氯化锂(LiCl)腹腔注射；20 h后按体重1 mg/kg予阿托品腹腔注射；间隔30 min后，按体重50 mg/kg腹腔注射匹罗卡品(PILO)，注射后5 h内观察大鼠的痫性发作并进行分级。发作标准按照动物痫性发作Racine分级标准[8]：0级：无抽搐发作；Ⅰ级：咀嚼、面部抽搐；Ⅱ级：点头样动作和孤立性肌阵挛；Ⅲ级：单侧前肢阵挛、抽搐样动作；Ⅳ级：全身性强直阵挛抽搐，伴站立；Ⅴ级：全身性强直阵挛抽搐伴站立跌倒，跳跃、持续性阵挛发作或抽搐致死。癫痫发作未达Ⅳ级者，按体重15 mg/kg追加PILO直至完全点燃出现癫痫发作。以癫痫发作时间点为起点，根据癫痫发作后时间分别于3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d及7 d等时间点选取大鼠，分为7个亚组，每亚组5只。为保证致痫组中大鼠存活时间，观察期间按体重10 mg/kg予腹腔注射地西泮。对照组操作相同，以同体积生理盐水替代LiCl和PILO腹腔注射，按相应时间点分为7个亚组，每亚组3只。

1.2.2动物标本的处理：致痫组和对照组各亚组大鼠均于相应时间点按体重4 mL/kg腹腔注射10%(质量浓度)水合氯醛，麻醉后快速断头取脑，并迅速在冰上剥离出双侧大脑半球海马组织和邻近颞叶皮层组织，置于-80℃超低温冰箱中保存备用。

1.2.3实时荧光定量PCR(qPCR)法检测脑组织SPARCL1和Integrinβ1的mRNA表达水平：用TRIzol Reagent提取各组织样本的总mRNA，用HiScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)将获得的mRNA分别反转录获得cDNA，用ChamQ SYBR qPCR Master Mix对获得的cDNA进行qPCR实验，以β-Actin作为内参，分别检测各组织样本中SPARCL1 mRNA和Integrinβ1 mRNA表达水平。SPARCL1、Integrinβ1和β-Actin基因引物信息见表1。

表1 SPARCL1、Integrinβ1和β-Actin基因引物信息

1.2.4蛋白免疫印迹杂交(Western blot)法检测SPARCL1和Integrinβ1蛋白表达水平：将冻于 -80℃冰箱的海马组织和颞叶皮层组织取出充分研磨，加入2%(质量浓度)SDS裂解液，混匀，室温裂解10 min，13 000g常温离心10 min，取上清液(即为蛋白裂解液)；采用2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠(BCA)法测定对应样品蛋白浓度，配平浓度后，将蛋白煮沸变性、凝胶电泳、转膜；5%(质量浓度)脱脂牛奶室温下封闭2 h，然后与SPARCL1一抗、Integrinβ1一抗及GAPDH一抗反应，4℃摇床过夜；二抗室温孵育 90 min。每步骤间用TBST洗3次，每次10 min，ECL室温显色，凝胶成像仪曝光成像。采用Image J软件分析各个条带的灰度值，并以其与内参GAPDH灰度值的比值表示该样品目的蛋白的表达量，分别计算出各组SPARCL1和Integrin β1的表达量。

1.3 统计学处理采用SPSS20.0软件进行分析。经Shapiro-Wilk正态性检验，所有数据均符合正态性分布，以均数±标准差表示。多组间数据比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA followed by Tukey HSD post hoc test)，多组间两两比较采用Tukey’s方法。SPARCL1和Integrinβ1的mRNA和蛋白表达水平的相关分析采用Pearson相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠行为学观察致痫组大鼠予PILO腹腔注射5～15 min 后，大鼠初表现为立毛、流涎、颤抖和结膜充血等，同时或先后出现痫性发作，如凝视不动、咀嚼、湿狗样震颤、头颈上仰，后发展为面肌抽搐、点头、反复双侧前肢阵挛、伴直立、跌倒或翻转、肢体和尾部强直等癫痫状态。以上状态维持1 h，发作间期完全停止，可正常活动。对照组大鼠实验期间均行为活动正常，均未有癫痫发作。

2.2 致痫组及对照组大鼠海马组织和颞叶皮层中SPARCL1和Integrinβ1表达水平比较对照组7个亚组大鼠海马组织和颞叶皮层中SPARCL1和Integrinβ1的mRNA及蛋白表达水平均差异无统计学意义(P>0.05)，故后续实验中均仅设1个对照组。

2.2.1两组海马组织SPARCL1 mRNA和蛋白表达水平比较：具体结果见表2、图1。致痫组3 h组、6 h组、12 h组和1 d组海马组织中SPARCL1 mRNA表达水平均较对照组下降(P<0.05)，致痫组2 d组、3 d组、7 d组与对照组差异均无统计学意义(P>0.05)，且2 d组、3 d组和7 d组的SPARCL1 mRNA水平均高于3 h组、6 h组、12 h组和1 d组(P<0.05)，致痫组3 h组、6 h组、12 h组和1 d组组间，以及致痫组2 d组、3 d组和7 d组组间，差异均无统计学意义(P>0.05)。

表2 两组大鼠海马组织中SPARCL1和Integrinβ1的mRNA和蛋白表达情况

注：3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、7 d：分别为致痫组中相应时间亚组;SPARCL1：分泌型酸性富含半胱氨酸样蛋白1型；Integrinβ1：整合素β1；GADPH：内参 图 1 两组大鼠不同时间点海马组织中SPARCL1蛋白和Integrinβ1蛋白表达情况(Western blot)

致痫组6 h组、12 h组、1 d组和2 d组海马组织中SPARCL1蛋白水平均低于对照组(P<0.05或P<0.01)，3 h组、3 d组、7 d组与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，且致痫组6 h组、12 h组、1 d组和2 d组低于致痫组3 h组(P<0.05)；致痫组6 h组、12 h组、1 d组和2 d组间比较，3 d组和7 d组组间比较，分别差异无统计学意义(P>0.05)，且致痫组3 d组和7 d组SPARCL1蛋白水平均低于3 h组。由上述结果推测，大鼠在癫痫发作后3 h至7 d内，大鼠海马组织中的SPARCL1 mRNA和蛋白表达水平均呈现先下降再恢复的趋势。其中，SPARCL1 mRNA表达从2 d开始恢复正常，SPARCL1蛋白表达水平从3 d开始恢复正常。

2.2.2两组海马组织Integrinβ1 mRNA和蛋白表达水平比较：与对照组相比，致痫组3 h组和6 h组海马组织的Integrinβ1 mRNA表达水平明显下降(P<0.01)，致痫组1 d组和2 d组显著增加(P<0.01)，其他各时间组差异无统计学意义(P>0.05)。

与致痫组3 h组、6 h组比较，致痫组12 h组、1 d组、2 d组、3 d组、7 d组Integrinβ1 mRNA表达水平均升高(P<0.05)。与致痫组12 h组比较，致痫组1 d组、2 d组Integrinβ1 mRNA表达水平均升高(P<0.05)，致痫3 d、7 d组Integrinβ1 mRNA表达水平均下降(P<0.05)。与致痫组1 d组、2 d组比较，致痫3 d、7 d组Integrinβ1 mRNA表达水平均下降(P<0.05)。

与对照组比较，致痫组6 h、12 h组海马组织的Integrinβ1蛋白表达水平下降(P<0.05)，致痫组3 d、7d组表达水平升高(P<0.05或P<0.01)，致痫组3 h组、1 d组、2 d组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

与致痫组3 h组比较，致痫2 d、3 d、7 d组Integrinβ1蛋白表达水平均升高(P<0.05)；与致痫组6 h组比较，致痫组1 d、2 d、3 d、7 d组Integrinβ1蛋白表达水平均升高(P<0.05)。与致痫组12 h组、1 d组比较，致痫2 d、3 d、7 d组Integrinβ1蛋白表达水平均升高(P<0.05)。与致痫组2 d、3 d组比较，致痫7 d组Integrinβ1蛋白表达水平升高(P<0.05)。

由此可见，在癫痫发作后的大鼠海马组织中的Integrinβ1 mRNA水平最初会出现下降，且在12 h后逐渐恢复甚至高于对照组。Integrinβ1蛋白水平在最初的12 h内会逐渐降低，此后则逐渐恢复甚至高于正常对照组。具体结果见表2、图1。

2.2.3两组颞叶皮层组织SPARCL1 mRNA和蛋白表达水平比较：与对照组比较，致痫组3 h组、6 h组和7 d组大鼠颞叶皮层中SPARCL1 mRNA表达水平显著升高(P<0.01)，致痫组12 h组和1 d组则明显下降(P<0.01)，2 d组和3 d组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。

与致痫组3 h组比较，致痫组6 h组、7 d组大鼠颞叶皮层SPARCL1 mRNA表达水平均下降(P<0.05)。与致痫组3 h组、6h组比较，致痫组12 h组、1 d组、2 d组、3 d组SPARCL1 mRNA表达水平均下降(P<0.05)。与致痫组12 h组、1 d组比较，致痫组2 d组、7 d组SPARCL1 mRNA表达水平均下降(P<0.05)。与致痫组2 d组、3 d组比较，致痫7 d组SPARCL1 mRNA表达水平升高(P<0.05)。

致痫组12 h组、1 d组、2 d组、3 d组和7 d组SPARCL1蛋白表达水平显著低于对照组(P<0.05或P<0.01)，致痫组3 h组、6 h组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

与致痫组3 h组、6 h组比较，致痫组12 h组、1 d组、3 d组、7 d组SPARCL1蛋白表达水平均下降(P<0.05)；与致痫组12 h组、1 d组、2 d组比较，致痫3 d、7 d组SPARCL1蛋白表达水平均下降(P<0.05)。与致痫组3 d组比较，致痫7 d组SPARCL1蛋白表达水平下降(P<0.05)。

由上述结果可见，在癫痫发作后，大鼠颞叶皮层中SPARCL1蛋白的表达呈现下调趋势，SPARCL1 mRNA的表达呈现前期上升后下调的波动趋势。具体结果见表3、图2。

表3 两组颞叶皮层组织中SPARCL1和Integrinβ1的mRNA和蛋白表达情况

注：3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、7 d：分别为致痫组中相应时间亚组；SPARCL1：分泌型酸性富含半胱氨酸样蛋白1型；Integrinβ1：整合素β1；GADPH：内参 图 2 两组大鼠不同时间点颞叶皮层组织中SPARCL1蛋白和Integrinβ1蛋白表达情况(Western blot)

2.2.4两组颞叶皮层组织Integrinβ1 mRNA和蛋白表达水平比较：与对照组相比，致痫组3 h组、6 h组和7 d组大鼠颞叶皮层Integrinβ1 mRNA显著增加(P<0.01)，其他组差异无统计学意义(P>0.05)。

与致痫组3 h组比较，致痫组6 h组Integrinβ1 mRNA表达水平下降(P<0.05)。与致痫组3 h组、6 h组比较，致痫组12 h组、1 d组、2 d组、3 d组、7 d组Integrinβ1 mRNA表达水平均下降(P<0.05)。与致痫组12 h组、1 d组、3 d组比较，致痫7 d组Integrinβ1 mRNA表达水平均上升(P<0.05)。

与对照组比较，除致痫组3 h组外，致痫组6 h组、12 h组、1 d组、2 d组、3 d组、7 d组大鼠颞叶皮层Integrinβ1蛋白表达均下调(P<0.05或P<0.01)。与致痫组3 h组、6 h组、12 h组、1 d组、2 d组比较，致痫3 d、7 d组Integrinβ1蛋白表达水平均下降(P<0.05)。与致痫组3 d组比较，致痫7 d组Integrinβ1蛋白表达水平下降(P<0.05)。

由此可见，在癫痫发作后的大鼠海马组织中的Integrinβ1 mRNA水平最初会升高，且在12 h后逐渐恢复甚至高于对照组；Integrinβ1蛋白水平呈现下降趋势。具体结果见表3和图2。

2.3SPARCL1和Integrinβ1的mRNA和蛋白表达水平的相关性分析致痫组大鼠海马组织中SPARCL1 mRNA和Integrinβ1 mRNA两者表达水平成正相关(r=0.684，P<0.01)，SPARCL1和Integrinβ1蛋白表达水平亦成正相关(r=0.724，P<0.01)；颞叶皮层组织中SPARCL1 mRNA和Integrinβ1 mRNA两者表达水平成正相关(r=0.908，P<0.01)，SPARCL1和Integrinβ1蛋白表达水平成正相关(r=0.852，P<0.01)。

3 讨论

癫痫是一种由于大脑神经元异常放电引起的以重复的自发性发作为显著特征的常见慢性脑病[1]。癫痫的发作能够扩散到大脑皮层，导致神经网络过度兴奋，与突触激发和突触抑制之间的不平衡密切相关[9]。

ECM是指细胞分泌的细胞外分子的集合，由两蛋白多糖和纤维蛋白(如胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白和层黏连蛋白)组成。ECM在组织形态发生、分化和体内平衡中发挥了重要的作用[10]。既往研究发现，海马中ECM分子如层黏连蛋白和基质金属蛋白酶-9等的变化而导致细胞外环境的黏附状态改变是癫痫发作活动的重要变化[11-12]，提示调节黏附的ECM分子可能在癫痫发作中参与突触重塑的过程。

SPARCL1 是一种由星形胶质细胞分泌的突触蛋白，通过与突触黏附蛋白相互作用来调节发育中大脑中谷氨酸能突触的形成[5]。既往研究表明，LiCl-PILO诱导的癫痫大鼠SE后，SPARCL1参与癫痫发生的突触修饰[13]。总而言之，SPARCL1在重建与发育生长相关的事件及LiCl-PILO诱导的SE后大脑突触重塑中发挥作用。Lively等[14]研究显示，SPARCL1在LiCl-PILO诱导的癫痫大鼠中的表达存在空间动态变化，主要表现在SE后1天内海马SPARCL1蛋白表达水平均显著下降，而之后逐渐升高，至第7天返回正常水平，提示SPARCL1蛋白可能参与癫痫的发生过程。既往研究发现，SPARCL1在海马CA2区的锥体细胞中没有变化，而在CA1和CA3区神经元出现瞬时增强的SPARCL1信号，但锥体细胞中的表达降低[14]。这表明，观察到的SPARCL1动态变化可能与DG区锥形细胞中SPARCL1的减少相关[15]。

整合素是α-β-异二聚体跨膜糖蛋白受体，整合素家族及其配体在调节神经元连接的相关过程(包括神经突生长、突触的形成和维持以及突触可塑性)的控制中发挥重要作用[4]。Pinkstaff等[16]发现在幼稚大鼠中海马神经元和星形胶质细胞Integrinβ1 mRNA表达水平很低，Robel等[17]研究表明整合素参与癫痫发作后的生理变化过程，尤其在调节神经元环路兴奋性和星型胶质细胞功能中并发挥了重要的作用。如一项哺乳动物研究显示，在星形胶质细胞中敲除Integrinβ1基因后能够诱导自发性癫痫发作[7]。Pinkstaff等[16]的研究发现，在LiCl-PILO建立的癫痫大鼠模型中，Integrinβ1在癫痫超急性期中先降低之后再升高。 此外，Gall等[18]和Venstrom等[19]认为，在癫痫发作期Integrinβ1蛋白表达增加，并且与神经突向外生长过程有关。

目前常用LiCl-PILO建立癫痫动物模型以研究癫痫致病机制[1]。LiCl-PILO能够诱导大鼠出现难治性内侧颞叶癫痫的急性期(1 d)、静止期(1周)和SRS自发发作期(30 d后)。因此，能够全面动态地观察难治性内侧颞叶癫痫形成的全过程。难治性颞叶癫痫临床发作复杂，治疗效果差，通过深入研究，不断了解颞叶癫痫发作的病理生理过程，选择多靶点联合药物治疗，减少癫痫发作次数，减轻患者痛苦。本研究通过应用该方法建立大鼠癫痫模型，分别在SE后的急性期和静止期观察致痫大鼠的海马和皮层组织中SPARCL1和Integrinβ1的mRNA和蛋白表达水平，结果显示致痫大鼠急性期SPARCL1和Integrinβ1的mRNA和蛋白表达均升高，静止期表达回落，且二者的表达水平存在正相关，提示SPARCL1和Integrinβ1二者很可能在癫痫发生早期具有重要作用，且二者在癫痫发作急性期和静止期内可能存在相互作用。然而二者在自发发作期的表达及其相互作用关系仍需进行后续研究。本研究表明二者在海马和皮层随着癫痫发生的时间变化出现表达差异，但其详细作用机制及是否存在多种分子相互调节，临床检测该指标能否早期识别癫痫发生过程，仍需要为进一步研究阐明。

综上，本研究提示SPARCL1和Integrinβ1在癫痫大鼠海马和邻近颞叶皮层中存在癫痫发作后的动态表达变化，且二者的表达变化趋势成正相关。