补肾活血方对子宫内膜干细胞移植治疗薄型子宫内膜大鼠子宫内膜CD34、整合素ανβ3、LIF表达的影响

尹晓丹，杨维，辛明蔚，武颖，何军琴

(首都医科大学附属北京妇产医院/北京妇幼保健院中医科，北京 100026)

薄型子宫内膜通常是指卵泡发育成熟(直径≥18 mm)时或人绒毛膜促性腺激素注射日，子宫内膜厚度≤7 mm，其在自然妊娠及辅助生殖技术周期中较常见，与植入率和妊娠率较低相关。虽然临床上也有子宫内膜在4 mm和5 mm时妊娠的报道，但子宫内膜厚度≤7 mm与妊娠率较低有关[1]。有研究表明，子宫内膜薄可导致1/2～2/3的妊娠失败[2]。目前，临床上治疗薄型子宫内膜主要有口服、肌内注射或局部应用雌激素以及促性腺激素释放激素类似物、他莫昔芬和生长激素等其他激素类治疗，亦有应用低剂量阿司匹林、西地那非等改善子宫内膜血流等治疗。从中医学角度将薄型子宫内膜归类于不孕症的治疗，认为肾虚、冲任二脉失养乃至不能摄精受孕；亦可由于胞宫损伤，气滞血瘀乃至不能成孕。肾虚与血瘀之间相互影响，因此补肾填精、益气养血活血是中医药对薄型子宫内膜的主要治法[3]。本研究主要探讨补肾活血方对子宫内膜干细胞(endometrial stem cells，EDSCs)移植治疗薄型子宫内膜大鼠子宫内膜CD34、整合素ανβ3及白细胞抑制因子(leukocyte inhibitor factor，LIF)表达的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1动物 选用20只无特定病原体级别8周龄雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重(200±30) g；42只8～10周龄雌性SD大鼠，体重(220±30) g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物生产许可证号：SCXK(京) 2016-0004；动物使用许可证号：SYXK(京)2015-0004。动物适应环境3 d；室温(22±1) ℃，湿度(40±10)%，光照周期12 h/12 h。本研究通过中研子创(北京)生物科技有限公司实验动物伦理委员会批准(批准文号：20190801LL)。

1.1.2药品及试剂 补肾活血方组成：淫羊藿10 g、肉苁蓉10 g、鹿角15 g、羌活6 g、细辛3 g等。煎药浓缩后，药物浓度为4 g/ml，置于4 ℃冰箱贮存备用。以上药物由北京同仁堂有限公司加工。戊酸雌二醇(德国拜耳公司生产，规格：1 mg/片)、羟基脲(齐鲁制药有限公司生产)、高分子右旋糖酐(瑞士Amwesham Biosciences公司生产，批号：Dextran70)，1%青霉素-链霉素(批号：15140122)、20%胎牛血清(批号：10099141)购自美国Gibco公司，CD34抗体(批号：bs-8996R)、整合素ανβ3抗体(批号：bs-1310R)、LIF抗体(批号：bs-1058R)购自北京博奥森生物技术有限公司，二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒(批号：PC0020)、十二烷基苯磺酸钠(批号：S8010)购自北京索莱宝科技有限公司，辣根酶标记的山羊抗兔IgG[天德悦(北京)生物科技有限责任公司生产，批号:S004F]等。

1.1.3仪器 双稳态数字电泳仪(上海双奇生物科技有限公司生产，型号：DYY-6C)、全波长扫描多功能阅读机(美国Termo公司生产，型号：6-1536)、生物组织扩增机(武汉中天设备有限公司生产，型号：KD-RS1)、自动组织包埋机(德国莱卡生物公司生产，型号：ZT-MS)、ChemiScope Mini 3300化学发光成像仪(上海勤翔科学仪器有限公司生产)等。

1.2方法

1.2.1EDSCs的分离及培养 将20只雌性大鼠颈椎脱臼法处死，取出子宫，浸入4%的多聚甲醛固定。将子宫组织切碎，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)冲洗，然后在胶原酶Ⅲ(300 mg/L)+DNA酶(40 mg/L)中消化，在37 ℃下搅拌30～45 min。将分散的细胞溶液通过一个70目的筛子，去除腺体上皮成分。将过滤后的细胞溶液离心(1 000×g，离心5 min)，倾出上清液并重新悬浮在最低限度的必需培养基中，加入酚红、1%抗生素-抗霉菌剂和20%胎牛血清。然后，将重新悬浮的细胞置于塑料瓶中，在37 ℃的湿润环境中维持。在37 ℃的加湿房间(5%的二氧化碳)中进行扩增，持续1周。用0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液消化上述原代细胞，并以1∶2传代。取第3代细胞，冷冻备用。

1.2.2肾虚血瘀薄型子宫内膜模型的建立 将42只SD大鼠依据随机数字法分为正常对照组、模型组、戊酸雌二醇组、EDSCs+尾静脉注射组、EDSCs+宫腔注射组、EDSCs+尾静脉注射+中药组、EDSCs+宫腔注射+中药组，每组6只。每日早上9:00观察阴道涂片，判断静止期后开始造模。除正常对照组外，其余组均造模。SD大鼠胃内灌服羟基脲450 mg/(kg·d)，连续10 d，从第4天开始皮下注射肾上腺素0.3 mg/(kg·d)，连续7 d。大鼠出现拱背、不爱活动、掉毛等，然后出现耳朵、爪子和尾巴发黑发紫，提示有血瘀，最终形成肾虚血瘀模型[4]；肾虚血瘀模型SD大鼠开腹找到子宫，向宫腔注入95%的无水乙醇。反复轻轻抽吸，冲洗子宫腔5 min，拔出针头，另一侧子宫按上述方法操作，关闭腹部。造模36只，均造模成功。

1.2.3干预方法 正常对照组：常规灌服0.9%氯化钠溶液；模型组：建模后常规灌服0.9%氯化钠溶液；戊酸雌二醇组：建模后按0.3 mg/(kg·d)剂量灌服戊酸雌二醇；EDSCs+尾静脉注射组：建模后，经尾静脉注射含107个EDSCs的PBS细胞悬液体1 ml；EDSCs+宫腔注射组：建模后，经宫腔注射含107个EDSCs的PBS细胞悬液体1 ml；EDSCs+尾静脉注射+中药组：建模后，经尾静脉注射含107个EDSCs的PBS细胞悬液体1 ml，并灌服补肾活血方40.1 g/(kg·d)；EDSCs+宫腔注射+中药组：建模后，经宫腔注射含107个EDSCs的PBS细胞悬液体1 ml，并灌服补肾活血方40.1 g/(kg·d)；补肾活血方剂量参照《药理实验方法学》[5]中剂量换算。连续灌胃3个动情周期。

1.3观察指标

1.3.1免疫组织化学法检测子宫内膜CD34、整合素ανβ3、LIF的表达 配制过氧化物酶阻断缓冲液和抗原封闭液；在封闭液中稀释1∶100的抗CD34、整合素ανβ3以及LIF抗体；石蜡切片常规脱蜡，将培养在盖玻片上的组织用4%多聚甲醛在-20 ℃下固定5 min，然后用PBS洗净。在4 ℃下将兔单克隆抗CD34、整合素ανβ3、LIF和兔单克隆抗phospho-CD34、ανβ3、LIF的一级抗体在盖玻片上过夜。PBS清洗后，用生物素化的第二抗体处理盖玻片，再次使用PBS清洗。使用氨基乙基咔唑作为底物处理组织，采用OlympusBX显微镜进行观察。

1.3.2Western blot检测子宫内膜CD34、整合素ανβ3、LIF的表达 将组织样品中加入预冷的无线电免疫沉淀反应实验裂解液，充分研磨后离心提取组织总蛋白。使用二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度进行定量。取等量蛋白样品(30 μg/样品)，加入变性非还原性蛋白上样缓冲液，97 ℃加热6 min变性，室温冷却离心后上样。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后，聚偏氟乙烯膜转膜，封闭液(含吐温20的Tris缓冲液/5%脱脂奶粉)封闭30 min。加入CD34、整合素ανβ3、LIF一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。含吐温20的Tris缓冲液洗膜后，加入辣根酶标记的山羊抗兔IgG(1∶3 000)，室温孵育1 h后，含吐温20的Tris缓冲液漂洗。加入ECL化学放光试剂显影。ChemiScope Mini 3300化学发光成像仪拍照，Quantity One软件分析蛋白表达量。

2 结 果

2.1EDSCs细胞形态观察 观察可见1 d后，少量贴壁细胞；3 d后，贴壁细胞明显增多，多呈纺锤形；培养4～5 d后，贴壁细胞可见漩涡状或放射状生长；7～10 d后，可见细胞菌落融合成片，覆盖在培养瓶底部，消化通过后细胞贴壁速度加快，见图1。后续实验选择第3代细胞。

图1 光学显微镜下子宫内膜干细胞形态(×100) 1a为第0代细胞培养第3天，1b为第3代细胞培养第3天

2.2免疫组织化学法检测的各组大鼠子宫内膜CD34、整合素ανβ3、LIF的表达 模型组CD34、整合素ανβ3、LIF的表达低于正常对照组(P<0.01)；戊酸雌二醇组、EDSCs+尾静脉注射组、EDSCs+宫腔注射组、EDSCs+尾静脉注射+中药组、EDSCs+宫腔注射+中药组的CD34、整合素ανβ3、LIF表达均高于模型组(P<0.05)；EDSCs+宫腔注射+中药组的整合素ανβ3、LIF的表达高于EDSCs+宫腔注射组(P<0.05)，但两组间CD34表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1，图2、3、4。

表1 各组SD大鼠子宫内膜CD34、整合素ανβ3、LIF表达的比较

图2 各组免疫组织化学检测CD34的表达(二氨基联苯胺法染色，×100) 2a为正常对照组，2b为模型组，2c为戊酸雌二醇组，2d为子宫内膜干细胞(EDSCs)+尾静脉注射组，2e为EDSCs+宫腔注射组，2f为EDSCs+尾静脉注射+中药组，2g为EDSCs+宫腔注射+中药组

图3 各组免疫组织化学检测整合素ανβ3的表达(二氨基联苯胺法染色，×100) 3a为正常对照组，3b为模型组，3c为戊酸雌二醇组，3d为子宫内膜干细胞(EDSCs)+尾静脉注射组，3e为EDSCs+宫腔注射组，3f为EDSCs+尾静脉注射+中药组，3g为EDSCs+宫腔注射+中药组

图4 各组免疫组织化学检测LIF的表达(二氨基联苯胺法染色，×100) 4a为正常对照组，4b为模型组，4c为戊酸雌二醇组，4d为子宫内膜干细胞(EDSCs)+尾静脉注射组，4e为EDSCs+宫腔注射组，4f为EDSCs+尾静脉注射+中药组，4g为EDSCs+宫腔注射+中药组

2.3Western blot检测的各组大鼠子宫内膜CD34、整合素ανβ3、LIF的表达 CD34表达：模型组低于正常对照组(P<0.01)；戊酸雌二醇组、EDSCs+宫腔注射组、EDSCs+宫腔注射+中药组高于模型组(P<0.01)，其他干预组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)；EDSCs+宫腔注射组高于EDSCs+尾静脉注射组(P<0.05)，EDSCs+尾静脉注射+中药组与EDSCs+尾静脉注射组比较差异无统计学意义(P>0.05)；EDSCs+尾静脉注射+中药组、EDSCs+宫腔注射+中药组高于EDSCs+宫腔注射组(P<0.05)。整合素ανβ3表达：模型组低于正常对照组(P<0.01)；戊酸雌二醇组、EDSCs+尾静脉注射组、EDSCs+宫腔注射组、EDSCs+尾静脉注射+中药组、EDSCs+宫腔注射+中药组高于模型组(P<0.01)；EDSCs+宫腔注射组、EDSCs+尾静脉注射+中药组高于EDSCs+尾静脉注射组(P<0.05)；EDSCs+宫腔注射+中药组高于EDSCs+宫腔注射组(P<0.05)，EDSCs+尾静脉注射+中药组与EDSCs+宫腔注射组比较差无统计学意义(P>0.05)。LIF表达：模型组低于正常对照组(P<0.01)；戊酸雌二醇、EDSCs+尾静脉注射组、EDSCs+宫腔注射组、EDSCs+尾静脉注射+中药组、EDSCs+宫腔注射+中药组均高于模型组(P<0.01)，其他干预组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图5。

表2 各组SD大鼠子宫内膜CD34、整合素ανβ3、LIF表达的比较

注：LIF为白细胞抑制因子，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，EDSCs为子宫内膜干细胞

3 讨 论

从第一个证明子宫内膜内存在成体干细胞的发现至今已有10年[6]。在这项研究中，子宫内膜组织中的干细胞收集后可以在体外大量扩增，且可用于自体或异体干细胞的移植，而不存在风险。Alawadhi等[7]报道，将EDSCs进行宫腔移植可以治疗宫腔粘连综合征。Musina等[8]研究发现，经血中可分离并培养出子宫内膜间充质干细胞，具有取材容易、无创等优点。EDSCs在维持子宫内膜组织动态平衡、月经后内膜修复和重建中发挥重要作用[5]。EDSCs自我更新和再生可补充、替代因月经期脱落、组织损伤和细胞凋亡而丧失的细胞并重建新的子宫内膜腔，是维持正常月经周期功能的细胞生物学基础[9]。

一项关于从7个欧洲生殖中心招募的782对夫妇的不孕研究发现，生育力随年龄增长而下降[10]。其中不孕的原因有输卵管、结核病等感染引起的盆腔炎症、子宫方面的问题、输卵管结扎、子宫内膜异位症以及高龄等[11]。子宫内膜容受性差是不孕症最常见的原因之一，影响胚胎植入。研究表明，中医药可以促进子宫的容受性[12]。本研究采用的补肾活血方是首都医科大学附属北京妇产医院中医科创始人赵松泉总结几十年临床经验所创。全方具有补肾益精、活血化瘀、调经促孕的功效。补肾药物配伍养血活血之品更能调畅气血，从而调节性腺功能。研究发现，本方通过补肾、养血、活血以调理月经治疗不孕症[3]。

CD34是一种跨膜磷脂蛋白，最早在造血干细胞和祖细胞中被发现[13]。在临床上，CD34与骨髓移植造血干细胞的选择和富集有关[14]。CD34不仅在间充质干细胞中表达，还在许多其他非造血细胞中表达[15]，包括间充质细胞和血管内皮细胞[16]。整合素ανβ3是最重要的细胞表面受体家族[17]。整合素ανβ3通过促进局部血管参与内膜的蜕膜过程而促进胚胎植入[18-19]。LIF蛋白在多种组织中表现出不同的生物学活性[20]。因此，本研究通过检测上述指标来评估子宫内膜容受性。本实验通过免疫组织化学及Western blot法对血管内皮细胞标志蛋白CD34进行检测，结果显示各干预组CD34表达均不同程度的增加，其原因可能是在建立肾虚血瘀薄型子宫内膜大鼠模型后，产生了无菌性的子宫内膜损伤，在采用尾静脉、宫腔注射EDSCs及灌服补肾活血方治疗后可以促进子宫内膜细胞的增生[21]。本研究进一步应用免疫组织化学和Western blot法检测子宫内膜容受性指标整合素ανβ3、LIF，结果显示各干预组大鼠子宫内膜整合素ανβ3、LIF的表达均增加，加用中药后效果更佳，提示移植EDSCs不仅可以促进子宫内膜细胞增生，还可以改善子宫内膜容受性。有研究发现，以小鼠EDSCs移植治疗能够修复损伤的子宫内膜[22]。亦有研究采用自体EDSCs移植治疗重度宫腔粘连，可以重建和修复子宫内膜[23]。

综上所述，补肾活血方可以增加EDSCs移植治疗薄型子宫内膜大鼠子宫内膜CD34、整合素ανβ3、LIF的表达，从而起到改善子宫内膜容受性的作用。内皮细胞的增生与子宫内膜容受性标志蛋白的表达并非呈线性关系。这种情况一方面可能由于存在实验误差，另一方面也提示应进一步探讨评价子宫内膜容受性的指标。