脂肪来源间充质干细胞的成软骨分化及其在膝关节软骨损伤修复中的研究进展

李新通，毛世刚，范宝珠，刘洋，潘玮敏，黄晓宇，刘凯

(1.青岛市市立医院康复医学科，山东 青岛 266071； 2.大理大学基础医学院，云南 大理 671000；3.西安体育学院运动与健康科学学院，西安 710068)

关节软骨是高度分化的结缔组织，可使关节具有较好的弹性以及几乎无摩擦的运动[1]。膝关节的软骨损伤较常见，60%～66%接受膝关节镜检查的患者会出现软骨损伤[2]。由于软骨无直接的血液、淋巴供应或神经支配，再生潜力有限，若不及时治疗可能发生进行性软骨变性，最终引起骨关节炎[3]。目前，临床常用的软骨损伤修复方法主要包括微骨折技术、软骨下骨钻孔和自体软骨细胞植入等，但可获得性有限且具有供体部位并发症，限制了其进一步临床应用[4]。近年来，随着组织工程技术的发展，间充质干细胞在修复软骨损伤方面已取得一定进展，且具有获得和培养相对容易、免疫原性弱、成软骨分化能力等特点，同时其安全性也得到证实[5]。脂肪来源间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)具有软骨分化潜能，且来源丰富、获取容易、同源性好、生长快速；此外，与骨髓间充质干细胞相比，ADSCs供体部位不良反应少，因此具有巨大的临床应用潜力[6]。近年来，研究者以ADSCs的成软骨分化机制为基础，从生长环境、培养条件等方面探索高效的ADSCs成软骨分化过程，并逐步应用于临床膝关节软骨损伤的治疗。现就ADSCs的成软骨分化及其在膝关节软骨损伤修复中的研究进展予以综述。

1 ADSCs的生物学特性

干细胞具有贴壁生长、表达特异性细胞表面抗原、自我更新和多向分化潜能等特征。Zuk等[7]于2001年首次发现人体脂肪细胞提取物具有干细胞特性，并将其命名为ADSCs。ADSCs来源广泛、取材方便，目前绝大多数ADSCs是通过脂肪抽吸术或脂肪切除术并经胶原酶消化、离心分离获得。研究表明，ADCSs接种24 h后，细胞贴壁呈大小不一的圆形、多角形或短梭形状；进入增殖期ADSCs 逐渐伸展，形态呈现出与成纤维细胞相似的长梭形[8]。国际脂肪应用技术协会指出，新分离的ADSCs 表型为CD31-/CD34+/CD45-/CD235a-，经过体外培养的ADSCs表型则为CD31-/CD44+/CD45-/CD73+/CD90+/CD105+[9]。由于ADSCs无明确的特异性表面抗原，未来应进一步关注体外ADSCs的高效分离和纯化。

ADSCs具有包括成软骨分化在内的多项分化潜能。体外和体内实验均显示，与骨髓间充质干细胞相比，ADSCs的软骨分化能力较低，但ADSCs增殖更快，能够较好地维持增殖分化潜能、抗氧化防御系统以及能量代谢等，使其不受所处疾病微环境的影响，从而更好地耐受缺血、缺氧等关节软骨微环境引起的凋亡，发挥抗炎作用，使ADSCs在病理环境中仍可调节微环境[4，10]。此外，ADSCs还具有不易凋亡、来源广泛、容易获得等优势[6]，且ADSCs的人类白细胞抗原-ABC表达相对较少，因此免疫排斥发生率更低，更适用于同种异体移植[11]。

但ADSCs的生物学特性受供者年龄、脂肪采集部位等影响，且随着年龄的增长，在端粒缩短、DNA损伤累积以及氧化应激等因素作用下，ADSCs的增殖能力逐渐降低[12]。Tang等[13]研究发现，来源于内脏的ADSCs具有更好的增殖效果，来源于皮下的ADSCs则在免疫抑制性以及成软骨潜能等方面具有优势。另有研究表明，取材于髌下脂肪垫的ADSCs表现出更强的抗炎和抗衰老能力，与皮下脂肪组织来源的ADSCs相比具有更佳的软骨缺损修复潜能[14-16]。因此，未来的研究应充分考虑ADSCs生物学特性的多重影响，从而更好地促进ADSCs在软骨损伤修复方面发挥高效的作用。

2 ADSCs成软骨分化过程及调控途径

2.1ADSCs成软骨分化过程 ADSCs的骨系分化与成脂分化相互联系，成脂分化诱导增强可抑制骨系基因，促进成脂基因表达；骨系分化诱导增强，与成脂分化相关的转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体保留于胞质中，成脂基因表达受到抑制，而与ADSCs分化为骨-软骨祖细胞相关的Runt相关转录因子2则从胞质转移至胞核，导致骨系基因表达增强，分化为骨-软骨祖细胞[17-18]。骨-软骨祖细胞具备成骨分化和成软骨分化能力，而成软骨分化受SRY相关高迁移率族盒蛋白9(SRY-related high mobility group-box 9，Sox-9)与Runt相关转录因子2平衡的调控，其中Sox-9保留软骨形态表型，而Runt相关转录因子2充当成骨分化的主要转录调节因子；经诱导向软骨细胞方向分化的骨-软骨祖细胞可稳定表达Sox-9，并促进Ⅱ型胶原、Ⅸ型胶原、蛋白聚糖以及软骨低聚基质蛋白等软骨基质蛋白的表达[16，19]。

2.2ADSCs成软骨分化调控途径 由于ADSCs具有多向分化潜能，将其应用于膝关节软骨损伤修复时应充分考虑使其向目标细胞类型的高效转化。目前的研究表明，可通过外源性生长因子及特定培养基、低氧环境、新型生物材料支架等调节ADSCs向软骨细胞分化[20]。

ADSCs分化为软骨细胞的倾向高度依赖于培养条件，将其置于特定的生长因子中更有利于ADSCs的成软骨分化。据报道，ADSCs的成软骨分化潜能减弱可能是由于缺乏转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1受体或骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信使RNA表达降低所致[21]。TGF-β超家族是目前主要的软骨诱导生长因子。有研究发现，ADSCs可通过TGF-β1途径促进糖胺多糖、Sox-9、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子-1α等表达，抑制破坏软骨再生的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-3和MMP-13的表达，同时调节具有抑制软骨细胞凋亡作用的胱天蛋白酶3的表达[22]，表明ADSCs对促进软骨细胞增殖及再生均具有积极作用。另有研究利用TGF-β3和BMP-6诱导ADSCs，结果发现，2～4周内软骨细胞形成并被Ⅱ型胶原蛋白包围，同时10个主要的软骨形成基因表达均上调，经组织学、免疫组织化学和基因表达谱证实，ADSCs在培养物中被转化为透明样软骨[23]。此外，TGF-β2、BMP-2、BMP-7、BMP-9以及BMP-14等也可使脂肪干细胞发生软骨分化，但大多需3～4周才能完全分化[19，24]。已有研究证实，一些生长因子(如成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1)可通过下调肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂基因的表达、激活磷酸化促分裂原活化的蛋白激酶等途径上调Sox-9的表达，发挥促进软骨形成的作用[11，18]。

由不同生长因子参与组成的培养基也被应用于体外诱导ADSCs成软骨分化。常见的方案包括：①杜尔贝科改良伊格尔培养基和TGF-β3、白蛋白(1.25 μg/ml)、地塞米松(1×107mol/L)、抗坏血酸(6.25 μg/ml)、转铁蛋白和胰岛素(6.25 μg/ml)[25]；②杜尔贝科改良伊格尔培养基+1%胎牛血清，TGF-β1(10 ng/ml)、抗坏血酸-2-磷酸酯(50 nmol/L)、胰岛素(6.25 μg/ml)[7]；③OriCell成软骨诱导分化培养基和TGF-β3、地塞米松、抗坏血酸、ITS细胞培养添加剂、丙酮酸钠以及脯氨酸[26]。虽然不同生长因子参与组成的培养基对体外诱导ADSCs成软骨分化的影响目前仍不明确，但良好的生物因子及化学因子环境最终可促进ADSCs成软骨分化。

此外，通过改变物理因子环境(如创造缺氧条件、离心重力刺激)，ADSCs也可选择性成软骨分化。低氧环境可使缺氧诱导因子稳定表达，从而促进ADSCs增殖及成软骨分化相关基因表达，以提高其软骨分化效率[27]。但不同浓度的氧对ADSCs成软骨能力的影响存在差异。培养环境限制在5%的氧气条件或可更好地提高ADSCs的软骨选择性和生成量，而1%～3%的低氧条件对ADSCs成软骨能力无影响[28]。此外，利用离心重力刺激和支架也可促进软骨发生。由离心力对细胞培养物施加压力等形成的机械力，可通过对细胞外应激的反应影响ADSCs的成软骨分化，且有利于降低污染风险、节约操作时间[29]。据报道，2 400×g条件下，15 min离心重力刺激可显著提高Sox-9基因和蛋白的表达水平[30]。

虽然在适当的诱导环境下ADSCs可分化为软骨，但软骨细胞在二维表面的生长容易达到接触抑制，长期培养会产生去分化，导致Ⅰ型胶原蛋白表达增加、Ⅱ型胶原蛋白表达减少[31]。而常见的三维培养方法主要包括微球培养、微团培养以及支架法，但微球培养和微团培养存在营养不足等缺陷，因此目前的研究更多地关注支架材料。大部分三维模型构造的关键在于模拟软骨细胞所处的天然软骨细胞外基质，借助于模型的理化性质和生物学特性形成接近生理状态的软骨结构[18]。合格的三维支架材料不但具备亲水性、细胞黏性、孔隙率、良好的力学性能以及可控的降解速率等优势，还可通过模仿生理环境或利用趋化剂诱导移行克服体外细胞间接触带来的生长抑制作用，增加细胞间交流[32]；同时，轻度缺氧状态还可通过激活磷酸化p38促分裂原活化的蛋白激酶、蛋白激酶B及缺氧诱导因子-1α信号通路上调Sox-9表达，具有良好的促软骨分化能力[33]。近年来，随着组织工程技术的发展，生物可降解乳酸-乙醇酸支架、非网眼聚乙醇支架、Ⅱ型胶原透明质酸支架、聚乙二醇聚丙炔共聚物蛋白支架、京尼平交联生物支架、3D胶原海绵支架、软骨脱细胞支架等不断出现，对促进ADSCs的软骨分化及性能的维持具有重要意义[34-35]。但目前的支架材料仍存在强度不足、软骨分化不全以及去分化等方面的缺陷，相信随着支架材料的不断改进，可制备出更具有临床应用价值、理想的软骨组织工程支架材料。

总之，ADSCs的成软骨分化是一个复杂的过程，高度依赖于生长环境及培养条件。虽然存在通用方法，但具体哪种条件组合可优化ADSCs的产量、提高软骨分化能力目前尚未达成共识，仍需未来进一步研究阐明。

3 ADSCs在膝关节软骨损伤修复中的应用

3.1动物研究 ADSCs凭借较好的成软骨分化能力成为治疗软骨损伤的潜在方法。目前的研究主要集中于由大鼠及兔等动物构建的膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)模型或软骨缺损模型的ADSCs治疗。Mei等[36]在KOA模型大鼠关节内注射悬浮于60 μl磷酸盐缓冲液中的单剂量ADSCs(1.0×106个细胞)观察其疗效，并从宏观和组织学角度评估发现，ADSCs的有益作用在治疗后4周出现，ADSCs治疗后大鼠的软骨退化显著减轻，但并未诱导生成新软骨，治疗后8周，与仅应用60 μl磷酸盐缓冲液的大鼠相比，应用ADSCs治疗的KOA大鼠关节软骨退变明显较弱。表明ADSCs可有效抑制软骨退变，后续研究也支持这一观点[37-38]。Zhou等[37]将ADSCs(2.0×106个细胞)注射入KOA模型大鼠的膝关节腔(每周2次，共8次)，结果发现ADSCs可通过诱导自噬减少促炎细胞因子分泌、抑制软骨细胞凋亡，并在调节成纤维细胞生长因子受体1、盘状结构域受体2、磷酸化钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ/钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ以及磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶B等信号转导方面发挥重要作用，减轻大鼠KOA症状。另有研究证实，与单独ADSCs或软骨细胞治疗相比，ADSCs(1.0×107个细胞)和软骨细胞共培养并单次注射3个月后，关节软骨再生能力显著增强[39]。表明ADSCs与其他物质共培养可能是提高ADSCs成软骨分化能力、修复软骨缺损的有效途径。此外，ADSCs在兔模型中也广泛应用。Dragoo等[40]分离新西兰白兔的自体ADSCs并在体外诱导后种植于纤维蛋白胶支架上培养1周，最后再移植至其软骨损伤区，8周后评估显示，新西兰白兔表面软骨损伤区被透明样软骨填充，软骨下骨全部被修复。研究表明，Ⅴ型胶原蛋白可通过增强ADSCs的增殖分化能力显著上调软骨相关基因Ⅱ型胶原a1和聚蛋白多糖的表达，下调Pou5fl(POU domain,class 5,transcription factor 1)的表达，诱导兔KOA模型软骨退行性变区域Ⅱ型胶原蛋白水平显著增加，并表现出软骨厚度和软骨细胞数量增加、蛋白聚糖丢失及凋亡软骨细胞数量减少等典型的关节软骨再生迹象[41]。胶原蛋白对软骨的黏附和形成至关重要，而Ⅴ型胶原蛋白是保持软骨骨架结构完整性的关键成分，未来应进一步揭示Ⅴ型胶原蛋白在ADSCs软骨修复过程中的潜在作用。此外，部分学者通过构建比格犬KOA模型、巴马小型猪软骨缺损模型等研究发现，ADSCs也可发挥促进细胞外基质合成、软骨细胞增殖以及抗炎等作用，并表现出积极的膝关节软骨修复作用[42-43]。但不同的ADSCs注射剂量和治疗方案均可在一定程度上影响疗效或研究结果，因此在进一步临床应用前还应在动物模型基础上严谨评估ADSCs的安全性及长期有效性。

3.2临床研究 虽然目前关于ADSCs的研究逐渐增多，且ADSCs作为修复膝关节软骨损伤的方法在动物模型中已显现出积极效果，但涉及人类受试者的研究仍较少。Spasovski等[44]应用浓度为(0.5～1.0)×107的ADSCs单次注射治疗KOA患者，软骨组织修复磁共振观察评分结果显示，患者膝关节软骨修复明显，且疼痛、膝关节功能等均显著改善。Koh等[45]通过关节镜检查发现，ADSCs(4.04×106个细胞)具有软骨再生促进作用。Jo等[46]通过随机双盲临床研究证明，使用自体ADSCs治疗膝关节软骨缺损具有积极作用，治疗后软骨缺损区域的软骨厚度增加，且有光滑的新生软骨生成；此外，ADSCs注射剂量与关节软骨再生量相关，1.0×108的ADSCs注射剂量可以更好地改善膝关节疼痛与功能障碍。但有研究指出，患者临床症状改善可能与ADSCs分泌的具有抗炎、免疫等功能的细胞因子或旁分泌有关，经ADSCs注射治疗后受试者的膝关节磁共振成像并未发生明显改变[47]。这一研究结果得到了Pers等[48]的支持。由于目前的研究有限且不同的研究中ADSCs来源、治疗方式以及评价方法不同，难以对各研究的结果进行比较，研究结果以及最终结论存在争议，未来仍需大样本研究和长期随访以探究确切的软骨修复证据。

关于ADSCs治疗的安全性，Lee等[49]研究表明，关节内注射ADSCs治疗KOA可有效抑制软骨损伤的发展，改善患者膝关节功能，且随访6个月未发生不良事件。但也有研究报道，脂肪采集手术后患者会出现轻微的不适和瘀伤，且经ADSCs治疗后部分患者仍存在疼痛、肿胀，且症状可持续3 d至4周[50]。此外，干细胞治疗在临床实践中还可能出现畸胎瘤、免疫排斥反应以及批次、剂量依赖性作用的非稳定性等问题，均需谨慎对待[51]。虽然目前人体试验研究中ADSCs软骨修复作用及安全性尚存在争议，但不可否认ADSCs疗法为膝关节软骨损伤患者提供了一种便捷的非侵入性治疗方案。目前尚不清楚ADSCs在人体内是直接通过修复软骨组织起作用还是通过信号分子促进软骨修复，因此ADSCs在膝关节软骨损伤修复中的作用机制、疗效及长期安全性仍需进一步研究。

4 小 结

组织工程化软骨与宿主的完美结合是软骨修复的终极目标。虽然ADSCs具有多向分化潜能，但通过TGF-β超家族等外源性生长因子、特定培养基、物理因子环境等也可促进ADSCs向软骨细胞高效分化。此外，ADSCs还具有取材方便、产量较高、免疫原性较低等生物特性，为膝关节软骨损伤修复提供了一种极有前景的治疗方法。但由于目前相关临床报道较少，其安全性和有效性还需更多高质量的研究验证。未来的研究应基于ADSCs的多重优势并以明确ADSCs成软骨分化机制为基础，深入探究体外ADSCs与生长因子及三维诱导环境之间的关系以及诱导成软骨分化完全的措施，进一步促进ADSCs在膝关节软骨损伤修复中的应用。