新风胶囊通过调控miR⁃126⁃VEGF/PI3K/AKT 信号通路改善类风湿关节炎患者血瘀状态的作用机制研究

林章英，汪 元，黄传兵，张皖东，王桂珍，陈瑞莲，龚 雪

（1.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230038；2.安徽中医药大学第一附属医院风湿病一科，安徽 合肥 230031）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种由于关节滑膜出现慢性炎症及免疫系统功能紊乱导致靶器官损伤为主要特点的自身免疫性疾病，可严重影响患者的生活质量，临床上主要表现为骨及关节软骨的破坏，血管炎及血瘀状态等［1，2］。RA的基本病理改变为滑膜炎、血管翳和血管炎等的形成，与患者体内高凝状态、血管内皮增生、血小板异常升高等密切相关。RA 属于“尪痹”范畴，中医认为久病必瘀，瘀血是导致本病缠绵难愈重要原因，瘀血为RA 的主要病因与病理产物，同时又作为其主要的发病机制贯穿在RA 疾病发生、发展过程。

本研究团队认为脾虚湿盛、气血亏虚、痰瘀互结是RA 的基本病机，提出“益气健脾通络”的治疗方法，创制新风胶囊（Xinfeng Capsule，XFC）运用于临床，疗效显著。前期研究发现，RA 患者体内普遍存在高凝状态［2］，而XFC 可能通过抑制异常活化的NF-κB 通路，升高抑炎因子白细胞介素-10（interleu‑kine-10，IL-10）的水平，降低致炎因子IL-17、IL-6 的水平，调节了机体细胞因子网络，从而使RA 患者体内的部分凝血酶原时间（activated partial thrombo‑plastin time，APTT）、凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、凝血酶时间（thrombin time，TT）、D 二聚体（d-dimer，D-D）、纤维蛋白原（fibrinogen，FBG）、血小板（platelet，PLT）、血小板激活因子、血小板活化因子-乙酰水解酶趋向新的一种平衡状态，进而改善RA 患者血瘀状态［3］。同时我们在临床中发现RA 患者中血管内皮生长因子（vascular endothelia growth factor，VEGF）表达水平增加，且与疾病活动密切相关［4］。VEGF 是一种极为重要的促血管生成因子，可与滑膜血管内皮上的受体结合，促进滑膜血管新生和血管翳形成，增加血管通透性和炎性因子的释放［5］，从而参与RA 血瘀病理进程。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinases，PI3K）/丝-苏氨酸蛋白激酶（serine-threonine kinase，AKT）信号通路与微血管损伤及血管新生的发生机制有关［6］，是VEGF 下游信号通路中极其重要的组成部分，可在血管生成中发挥着调节作用，过表达PI3K或AKT 能诱导广泛的新血管生成及增大已存在的血管［7］，与RA 患者的血瘀状态密切相关。而miR-126 是血管新生信号通路中的正向调节因子，过表达miR-126 可激活VEGF/PI3K/AKT 信号通路，增强血管通透性，促进滑膜血管翳形成［8］。本文通过观察miR-126-VEGF/PI3K/AKT 信号通路的变化，探讨XFC 改善RA 血瘀状态的可能机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择60 例就诊于我院风湿免疫科住院的RA患者，住院时间为2020 年5～12 月。其中男性23例，女性37 例，年龄27～70 岁，病程最短1 年，最长23 年。依据随机数字表法分为XFC 治疗组30 例和来氟米特（LEF）对照组30 例。两组在性别、年龄、病程方面比较,差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究已获得安徽省中医院伦理委员会批准，患者已签订知情同意书。

1.2 诊断标准

参照2010 年美国风湿病学会和欧洲抗风湿病联盟共同提出的RA 分类标准［9］，总分≥6 分可诊断为RA。

1.3 血瘀证症状的评分标准

中医证型标准按照《中药新药临床研究指导原则》制定了“血瘀证症状分级量化表”［10］。将关节刺痛、唇色、舌质、脉象、皮下瘀斑、肌肤甲错根据不同程度按照正常、轻、中、重，分别计为0、1、2、3 分。

1.4 纳入标准

（1）符合上述诊断标准；（2）符合活动期诊断标准者；（3）年龄18～75 岁；（4）曾经使用非甾体类抗炎药及慢作用抗风湿药的患者，须停药3 个月以上才可入组。（5）自愿签署知情同意书。

1.5 排除标准

（1）不符合上述诊断标准的患者；（2）合并有严重疾病以及严重关节外表现；（3）精神异常的患者；（4）孕妇或哺乳期女性；（5）被研究者认为不宜进行此项临床试验者。

1.6 治疗方案

治疗组予以口服新风胶囊（3 粒，3 次/d），对照组予以口服来氟米特片（1 粒，1 次/d），均连续服用30 d。两组患者在研究中可根据情况使用非甾体消炎止痛药，但要避免使用免疫抑制剂及治疗RA 的其他中成药。

1.7 实验室指标检测

D-D、FBG、TT、APTT、PT、PLT、血小板平均体积（mean platelet volume，MPV）、血小板分布宽度（platelet distribution width，PDW）、红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C 反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、类风湿因子（rheumatoid factor，RF）、抗环瓜氨酸肽抗体（anti-cyclic citrulli‑nated peptide，CCP）均由安徽省中医院检验中心检测。

1.8 ELISA 检测血清

按照ELISA 试剂盒说明书操作测定VEGF、PI3K、AKT、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、IL-6 和IL-35 水平。

1.9 实时荧光定量PCR 法检测miR-126

根据实时荧光定量PCR 试剂盒说明书检测miR-126 含量。

1.10 统计学处理

采用SPSS 21.0 软件进行数据分析，数据以xˉ±s或者中位数（四分位数间距）表示，两组比较采用t检验或非参数检验，相关性分析采用spearman 分析。P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组治疗前后血瘀症状积分比较

与治疗前相比，两组治疗后血瘀症状、体征明显改善（P<0.05～0.01）；与LEF 组治疗后相比，XFC 组治疗后关节刺痛、舌质、皮下瘀斑、血瘀总积分明显改善，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 两组治疗前后血瘀症状积分比较(分，n=30)Tab 1 Comparison of blood stasis symptom score between the two groups before and after treatment (score，n=30)

2.2 两组治疗前后炎症指标、细胞因子比较

与治疗前比较，治疗后两组CRP、ESR、RF、CCP、IL-6、TNF-α 等指标均显著下降，IL-35 显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。与LEF 组比较，XFC 组IL-35 治 疗 后 较LEF 组 升 高 明 显，ESR、TNF-α、IL-6 降低明显，差异具有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。见表2。

表2 两组治疗前后炎症指标、细胞因子比较(n=30)Tab 2 Comparison of inflammatory indicators and cytokines between the two groups before and after treatment (n=30)

2.3 两组治疗前后血瘀相关指标比较

与治疗前相比，治疗后两组的D-D、FBG、PLT下降，差异有统计学意义（P<0.01），APTT、TT、PT、MPV、PDW 无明显改变，差异无统计学意义（P>0.05）；与LEF 组相比，XFC 组D-D、FBG、PLT 下降更明显，差异有统计学意义（P<0.01）。见表3。

表3 两组治疗前后血瘀相关指标比较(n=30)Tab 3 Effects of the two groups on blood stasis related indexes in RA patients (n=30)

2.4 两组治疗前后miR-126、VEGF、PI3K、AKT 的比较

与治疗前相比，两组治疗后miR-126、VEGF、PI3K、AKT 水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与LEF 组 治 疗 后 相 比，XFC 组 治 疗 后VEGF、miR-126、PI3K、AKT 水平降低更明显，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。见表4。

表4 两组治疗前后miR-126、VEGF、PI3K、AKT 的比较(n=30)Tab 4 Effects of the two groups on miR-126，VEGF，PI3K and AKT in RA patients (n=30)

2.5 RA 患者血瘀指标与细胞因子、miR-126、VEGF、PI3K、AKT 相关性分析

RA 患者血瘀总积分与CRP、ESR、RF、CCP、TNF-α、IL-6、miR-126、VEGF、PI3K、AKT 成正相关，与IL-35 表达成负相关（P<0.05，P<0.01）；D-D与CRP、ESR、CCP、IL-6、VEGF 成 正 相 关（P<0.05，P<0.01）；FBG 与CRP、CCP、VEGF、PI3K、AKT 成正相关（P<0.05，P<0.01）；PLT 与CRP、ESR、RF、CCP、TNF-α、IL-6、VEGF、PI3K、AKT成正相关（P<0.01）；MPV 与PI3K 成负相关（P<0.01）；PDW 与CCP 成负相关（P<0.05）。见表5。

表5 血瘀指标与细胞因子、miR-126、VEGF、PI3K、AKT 相关性分析（r）Tab.5 Correlation analysis of blood stasis indicators with cytokines，miR-126，VEGF，PI3K and AKT（r）

3 讨论

RA 属于中医“历节病”、“风湿”、“鹤膝风”、“白虎病”的范畴，其早见于《素问·痹论》，与风、寒、湿三气有关。而RA 的发病不仅与风寒湿等外感邪气有关，与内因也有关系，《医宗金鉴·痹症总括》指出：“脾虚谓气虚之人病诸痹也”。指出脾气亏虚，正气不足，是RA 血瘀形成主要病理基础，本团队在临床实践中将“从脾论治”应用于临床，研制出新风胶囊治疗RA，新风胶囊主要由黄芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣四位药物组成。刘赟等［11］研究发现，黄芪注射液的早期干预，能调节凝血酶-抗凝血酶复合物、血小板的水平，改善微循环障碍。薏苡仁新芽提取物可以使PI3K/AKT 通路失活，致使细胞周期延长和细胞凋亡，减少血管新生［12］。同时，薏苡仁注射液可下调实验性腹腔粘连大鼠血管内皮细胞因子水平表达，从而进一步抑制纤维蛋白原释放，同时可降低促炎细胞因子IL-1、TNF-α 的表达水平［13］。雷公藤甲素可抑制血小板的病理性聚集，与此同时也有调节机体血瘀状态的作用［14］。蜈蚣可使小鼠TT、APTT、PT 明显延长［15］，改善血瘀状态。纵观全方，XFC 具有健脾化湿、活血通络之效，对RA 血瘀状态有明显疗效。

现阶段血瘀证发病机理尚未完全研究清楚，但多数研究者认为其具体表现为高黏滞状态和高凝状态，而凝血与血小板相关指标是判定血瘀证的重要实验室指标［16-18］。因此，凝血与血小板相关指标有助于在RA 疾病早期发现患者血瘀状态的改变从而指导临床选方用药，更好地延缓RA 患者的疾病进展。本团队前期研究发现［19］，与正常组比较，RA患者外周血中D-D、FBG、PLT 显著升高（P<0.01），TT 延长（P<0.01），RA 患者外周血中凝血与血小板相关指标与临床症状体征、DAS28、疾病活动性指标成正相关，因此RA 患者血瘀状态的预防和改善有重要临床意义。本研究发现，XFC 组可以改善疾病活动性指标、血瘀症状体征，降低血瘀症状总评分、D-D、FBG、PLT（P<0.05，P<0.01）水平。与LEF 组相比，XFC 组治疗后降低更明显（P<0.05，P<0.01），提示新风胶囊在缓解RA 患者活动的同时，还可改善其血瘀状态。

RA 血瘀状态的机制可能与血管新生及血管翳的形成密切相关。VEGF 是血管新生的诱导介质［20］，是血管翳形成的关键因子。同时，VEGF 在其下游PI3K-AKT 的信号级血管新生中，VEGF 可作为血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，促进内皮细胞增殖和迁移，同时还可以促进间质胶原酶分泌，降解细胞基质［21］。PI3K/AKT 作为VEGF 的下游信号通路，可经由PI3K-AKT 下游分子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体2 和叉头转录因子促进内皮细胞增殖和血管新生［22，23］，参与血瘀状态的发成。miR-126 可通过调控VEGF 表达对血管内皮细胞发挥调节功能［24］，促进血管新生，与RA 血瘀状态密切相关。同时，miR-126 可通过影响PIK3R2 基因，从而调控PI3K/AKT 信号通路而发挥其在血管新生、细胞增殖、分化迁移等功能［25］。有研究指出在体外实验中，IL-35 能抑制VEGF 诱导的人脐静脉血管内皮细胞迁移、成管及血管生成素2 的分泌［26］。TNF-α 可以促进内皮细胞黏附白细胞，进而刺激内皮细胞分泌炎性物质，从而激活凝血系统，抑制纤溶［27］，且TNF 与其受体结合以后可以影响VEGF的增殖与迁移，影响类风湿关节炎患者血管增生水平，导致骨与软骨的损伤［28］。IL-6 促进RA 血管增生 主 要 是 通 过 与TNF-α、IL-1 及IL-17 的协同作用而增加VEGF 及CCL28 的表达［29］。本次研究发现，RA 患者血瘀总积分、血瘀相关指标与TNF-α、IL-6、IL-35、miR-126、VEGF、PI3K、AKT 均具有相关性。说明RA 患者的血瘀状态与miR-126-VEGF/PI3K/AKT 信号通路及炎症因子密切相关。XFC治疗后，疾病活动性指标、miR-126、VEGF、PI3K、AKT、TNF-α、IL-6、D-D、FBG、PLT 水平明显下降（P<0.01），IL-35 显著升高（P<0.01），提示XFC 可能对miR-126-VEGF/PI3K/AKT 信号通路具有抑制作用，下调促炎因子IL-6、TNF-α 水平，上调抑炎因子IL-35 水平，从而降低D-D、FBG、PLT 水平，缓解RA 血瘀状态。

综上所述，miR-126-VEGF/PI3K/AKT 信号通路的异常活化与RA 患者的血瘀状态密切相关，XFC 可以改善RA 患者的血瘀状态，其机制可能是通过抑制miR-126-VEGF/PI3K/AKT 信号通路的活化，调节细胞因子网络，从而达到延缓或抑制血瘀状态，减少关节病变。本研究仅进行了临床研究，将在今后的实验中进一步开展细胞实验加以验证，以提高结论的可靠性。

作者贡献度说明：

林章英：完成数据采集，分析数据，撰写论文等；汪元：设计实验，并对论文提出指导意见；黄传兵、张皖东、王桂珍、陈瑞莲、龚雪：参与研究设计和研究实施及收集数据。