代谢组学技术在噪声性聋研究中的应用

戚国伟于宁杨仕明韩东一*

1解放军总医院第六医学中心耳鼻咽喉头颈外科医学部；国家耳鼻咽喉疾病临床医学研究中心；聋病教育部重点实验室；聋病防治北京市重点实验室；（北京 100853）

2海军军医大学研究生院（上海 200433）

3解放军总医院研究生院（北京 100853）

研究表明，长期噪声暴露会对呼吸、循环、消化等全身多器官和系统造成损伤，这其中最为直接的就是听力损失[1,2]。目前针对噪声性聋（Noise in-duced hearing loss,NIHL）的发病机制、病理学变化、临床治疗及预防都开展了大量研究[3]。随着对NIHL认识的深入，相应研究手段的革新需求也与日俱增。近年来，组学技术在医学领域研究中的应用突飞猛进，在不断突破既往瓶颈问题的同时，取得了一系列革命性的发现[4]，因此也越来越受到听觉科学研究的青睐。本文将对近年代谢组学在听觉科学研究，尤其是NIHL方面的基础与临床研究应用做以综述。

1 代谢组学

1.1 代谢组学研究方法

代谢组学技术起始于20世纪70年代，Ferenci等于1998年首次进行了系统阐述与定义[5]。经过几十年的发展，现在代谢组学已经成为一种可以精确定量分析复杂生物系统内多种代谢物水平及其变化的技术。在生物信息分析、多元统计分析及数据挖掘等技术的支持下，代谢组学已广泛应用于病理生理机制、疾病标志物等领域研究[6]。代谢组学可以根据研究目标的确定性分为非靶向代谢组学和靶向代谢组学。非靶向代谢组学又称为发现性实验，是对样本中所有代谢物进行全面分析的一种方法，可用于初步筛选目标代谢物。因为不做预先假设，所以会产生大量数据，重复性及针对性较差[7]。靶向代谢组学又称为假设驱动实验，是以高精度的化学计量方法对样本中特定代谢物进行定量分析的一种技术[6]。代谢组学研究的样本种类广泛，从细胞、血液、组织液、粪便，到组织、器官，甚至是完整的活体标本，都可以进行代谢物分析。医学研究中较为常用的样本是血液、尿液及组织器官等[8]。代谢组学的研究对象主要是分子量在1000 kDa以内的小分子物质[9]。

1.2 代谢组学分析技术

医学研究样本包含的代谢物种类繁多，浓度、分子量、极性、亲水性等特质不尽相同，这对于代谢物的检测、识别及定量分析都提出了极大的挑战。当前，还没有一种技术可以精确检测出样本中的所有代谢物。因此，多种检测技术结合互补成为广泛应用的策略。目前，代谢组学应用最广泛的分析技术是核磁共振技术（Nuclear magnetic resonance，NMR）和质谱技术（Mass spectrometry，MS）[10,11]。

NMR技术是一种利用不同原子核吸收辐射产生不同共振频率，将这些共振频率转化为分子化学和结构信息的光谱技术[12]。NMR光谱分析技术中，样品制作简单并可重复使用，是一种快速、高效的非靶向分析方法，适合代谢物的定性和定量研究[11]。但由于灵敏度较低，制约了其在靶向代谢组学中的广泛应用。

MS分析是利用电场和磁场将运动的离子按质荷比（m/z）分离并进行检测的方法。在实际操作中，未结合色谱的MS方法有直接输注质谱法（DIMS）和流动注射质谱法（FI-MS）两种。基于MS的代谢组学通常联合色谱进行成份分析，目前MS联用的色谱主要为液相色谱-质谱联用技术（liquid chromatography-MS，LC-MS）和气相色谱-质谱联用技术（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）两类。LC-MS对代谢物的覆盖广、灵敏度高，无需衍生处理，可检测到1000种以上的代谢物，适用于不易挥发、热稳定性低、弱极性或中性的代谢物[13]。GC-MS具有高分离效率、高灵敏度的特点，在样品分析之前需要进行衍生化处理，适用于挥发性强、热稳定性好的非极性或极性代谢物[5]。

2 代谢组学在NIHL基础研究中的应用

当前代谢组学在NIHL的基础研究中应用较少，样本大多为耳蜗淋巴液，部分研究的样本为脑组织。由于实验动物的耳蜗淋巴液容量有限，取材存在一定困难，易被组织液、血液污染等因素都一定程度的制约了代谢组学的应用。目前，对于耳蜗淋巴液的代谢组学分析技术、流程尚未形成统一标准，不同研究所得结果也存在一定差异。在代谢组学分析技术方面，应用LC-MS的研究较多，也有部分研究采用GC-MS。以脑组织为标本的研究中，GC-MS为主要的分析方法[14]。

Lingchao Ji等[15]利用CBA鼠作为实验动物，探究急性噪声损伤后内耳淋巴液的代谢物变化情况。通过LC-MS发现，在受到可导致隐性听力损失（hidden hearing loss,HHL）的 噪 声（8-16KHz，100dB，2h）暴露后即刻，实验动物耳蜗淋巴液内核苷酸、辅酶因子、碳水化合物以及谷氨酸盐等25种代谢物上调，主要涉及丙氨酸、天冬氨酸、嘌呤、谷氨酰胺以及谷氨酸盐等的代谢。甲硫氨酸、精氨酸等15种代谢物下调，主要涉及苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等的代谢（详见表1）。此外，研究还发现不同噪声强度、暴露时间均会导致内耳淋巴液中代谢物的不同变化，为不同条件噪声暴露与内耳损伤之间的研究提供了全新的视角与思路。

Kristian Pirttilä等[16]针对脉冲噪声暴露以及氢气防护对内耳淋巴液代谢物的影响进行了深入研究。研究中，实验动物的左耳接受156dB，400次的脉冲噪声暴露，而后吸入浓度为2%的氢气1小时。利用LC-MS技术分别对实验动物的双侧内耳淋巴液进行代谢组学分析后发现，脉冲噪声暴露组与氢气治疗组相比，有7种代谢物在双侧内耳都产生了显著变化。其中，水苏碱、高水苏碱等在噪声暴露组的含量显著下降，U539（[C8H18NO2]+）、U547（[C7H8NO2]+）在噪声暴露组的含量上升。泛酸、肌酸、丁酰肉碱、乙酰肉碱等8种代谢物仅在两组实验动物的右耳表现出显著差异，噪声暴露组明显高于氢气治疗组（见表1）。酰基肉毒碱类代谢物与细胞氧化应激反应关系密切，氢气治疗组中该类代谢物显著下调说明了氢气对NIHL的治疗作用与减轻毛细胞氧化应激反应、减少由活性氧（ROS）导致的细胞毒性相关。同时，具有调节细胞容量作用的渗透保护性代谢物水苏碱、高水苏碱浓度在氢气治疗组也显著上调，提示氢气对NIHL的治疗作用存在其他潜在机制，值得深入研究。除此以外，该研究还从内耳淋巴液代谢的角度证实，即使是单侧耳受到噪声暴露，双侧都会发生类似的代谢变化。Kristian Pirttilä认为这种变化的产生，与骨导听力的影响密不可分。虽然骨导听觉的产生机制尚不清楚，但内耳淋巴液代谢物的变化也为该领域研究提供了全新的角度与方法。Takeshi Fujita等[17]利用GC-MS技术对内耳淋巴液的成份分析进行了探索性研究。在经过4kHz，126dB，2小时的噪声暴露后，分别于2小时、24小时取内耳淋巴液。分析结果显示，噪声暴露后2小时，内耳淋巴液中3-羟基丁酸、甘油、富马酸、丙酮酸盐、磷酸盐、柠檬酸+异柠檬酸、甘露糖等7种代谢物含量升高。噪声暴露后24小时，内耳淋巴液中3-羟基丁酸、富马酸、磷酸盐、赤藓糖醇、柠檬酸+异柠檬酸等5种代谢物含量升高，甘油、半乳糖胺、甘露糖、肌糖等4种代谢物含量降低。在取内耳淋巴液的同时，该研究还在相同时间点取血浆进行了代谢组学分析。结果表明，在内耳淋巴液中显著变化的10种代谢物并未在血浆中发生明显变化，这可能与差异代谢物的膜通透性及血迷路屏障的作用有关。该结果提示，对于NIHL的代谢通路及分子机制等方向研究，血浆作为研究样本的代表性较低，不适合作为单一样本来源进行分析。同时，在NIHL临床标志物研究方面，血浆样本的代表性也值得深入探讨。除了内耳淋巴液，Jun He等[14]还利用小鼠的脑组织作为样本，采用GC-MS进行研究。在给实验动物16KHz，110dB，1h的噪声暴露后，取全部脑组织作为标本，并根据大脑不同结构、功能划分为12个亚区。代谢组学分析结果发现，尿素、氨基酸、GABA、脂肪酸、核苷、有机酸等17种代谢物发生显著变化，涉及嘌呤、谷胱甘肽、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸盐、精氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸以及苏氨酸等的代谢。这些变化不仅限于听觉功能亚区，非听觉功能区也有出现。这表明，噪声暴露对于中枢的影响，不仅局限于听觉功能区。当前，噪声所致的耳鸣是困扰听觉研究的难题。耳鸣的产生机制复杂，涉及中枢多个功能区域，既往研究手段往往只针对个别区域，无法整体分析所有功能区的变化。通过代谢组学技术，由各区域的差异代谢物推导整体代谢通路变化，进而将各功能区结合，可能为耳鸣的中枢机制研究带来全新发现！

表1 不同实验室代谢物变化研究对比表Table 1 Different results of metabolite changes

总的来说，当前应用代谢组学的NIHL基础研究较少，实验流程、质量控制、技术参数及标准不尽相同，所得结果也略有区别，这与不同研究的实验设计以及技术自身的局限性有关。在所有发表的研究中，氨基酸类、谷氨酸盐类以及有机糖类代谢物都有所涉及，说明NIHL的产生与以上物质的代谢高度相关。

3 代谢组学在NIHL临床研究中的应用

同基础研究类似，当前代谢组学在NIHL临床研究中应用也较为有限。受限于样本来源，淋巴液只能从人工耳蜗手术患者[18]及部分迷路切除术患者获取，且难以得到正常对照，很大程度限制了代谢组学的应用。有学者采用血浆作为样本，对NIHL的长期效应进行探究[19]。在分析技术方面，绝大部分研究均采用LC-MS。

Sylvie Mavel等[18]就应用 LC-HRMS（liquid chro-matography–high resolution mass spectrometry）分析人类内耳外淋巴液的可行性进行了探究。研究选取23名因双侧极重度感音神经性耳聋而拟行人工耳蜗植入的患者，于术中打开圆窗后使用特殊的毛细针管吸取外淋巴液。由于患者个体差异及术中操作等影响，单个样本淋巴液容量为0.8μl-2 ml之间。为进行对照，研究选取与内耳淋巴液产生、循环高度相关的脑脊液作为参照。由于样本容量远低于代谢组学其他常规样本检测量，研究对实验流程中样本分离、提纯、质控等各个环节都进行了优化。结果提示：从脑脊液和内耳外淋巴液中可以分别稳定检测出94和74种代谢物，有38种代谢物被同时在两种样品中检测出来。这说明，通过优化技术，可以解决样本量有限等问题，且所得结果稳定可靠。此外，研究将人耳淋巴液代谢物与豚鼠淋巴液代谢物进行了对比，仅有15种代谢物同时存在于两物种的淋巴液中。其中，乳酸盐在两物种的淋巴液中均有很高的含量，谷氨酸盐、缬氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、琥珀酸盐、苏氨酸、赖氨酸、甘氨酸、核糖、阿糖醇、伽马氨基丁酸（GABA）、o-磷酸乙醇胺和葡萄糖醛酸酯均有不同强度信号，肌酸酐在豚鼠仅可检测到微量信号。从代谢物角度所反馈出的表型信息说明，人类内耳的代谢物及相关通路具有一定种属特异性，由实验动物所得的成果要转化为临床应用还有大量难题亟待破解。Long Miao等[19]利用LC-MS技术，就长期噪声暴露对人体血浆代谢物的影响进行了研究。研究选取62名在工厂中接触噪声一年以上、无耳聋家族遗传史的工人，纯音测听结果在3、4、6kHz处的阈值均高于25dB。对血浆样本代谢物分析后发现，与正常对照组相比，共有207种代谢物含量变化。其中，136种代谢物含量上调，71种代谢物下调，20种代谢物（脂质分子、脂肪酸等）含量差异显著。代谢通路结果表明，甘油磷脂、糖基磷脂酰肌醇（GPI）、胆碱、α-亚麻酸、亚油酸以及内源性大麻素的代谢均与NIHL的产生及进展相关。利用RT-qPCR技术，研究发现与自噬通路相关的3种mRNA含量显著下调，这说明自噬通路与NIHL的发生关系密切。同时，其他代谢通路及相关代谢物的发现也为NIHL血浆标志物的研究提供了启发与参考。该研究的设计思路以及代谢组学技术的应用都为NIHL临床研究开辟了新方向。

现阶段应用代谢组学技术的NIHL临床研究数量有限，这其中最主要的制约因素是研究样本的来源。内耳淋巴液是人耳在噪声等环境因素影响下代谢变化最为直接和全面的反应载体，因此也是最理想的研究样本。从动物实验已知，不同条件的噪声暴露、噪声暴露后不同时间段，内耳代谢情况都不尽相同。如能掌握关键代谢物含量的动态变化，通过代谢通路揭示其与听力损失之间的关系，并用药物加以阻断干预，就能有效预防、治疗NIHL。尽管这些设计是在实验动物中进行探索，但能为临床应用提供相对直接的参照。除此以外，安全、稳定且可靠的内耳淋巴液获取方式是所有临床研究面临的首要难题，这不仅关系到研究的开展，也制约着研究成果的应用。耳蜗血迷路屏障在保护内耳环境相对独立稳定的同时，也限制了药物进入。如前述问题能够攻克，定会为内耳疾病的治疗带来革命性的突破！

4 代谢组学在NIHL的研究应用展望

代谢组学近年来发展迅猛，其在生物医学研究中的应用已涉及病理机制、疾病标志物、药物治疗、预后转归等多个领域[6]。随着可分析代谢物种类的持续增加，目标代谢物分析临界浓度的不断降低，结合生物化学、生物信息分析、统计分析等相关技术的发展，以及基因组、转录组和蛋白组等多组学的联合应用，必将为生物医学研究带来不断突破。当前，代谢组学在NIHL研究中的应用较为局限，制约因素主要为：（1）样本来源受限；（2）样本容量小；（3）技术流程缺乏统一标准、规范；（4）缺少权威性的数据参照。

要拓展代谢组学的应用范围，不仅仅需要技术本身的革新，微创、可重复的内耳淋巴液获取方式是当前最急需突破的难题。借助代谢组学，NIHL研究有望在以下四个方面取得突破性进展：（1）不同噪声所致损伤及恢复全过程代谢通路动态变化；（2）NIHL精准治疗及预防策略；（3）骨导听觉产生机制；（4）噪声易感性基因筛选及分子机制。