承德市25,205例新生儿聋病易感基因分子流行病学调查分析

薛秀丽翼楠 张娇李春美程云赵艳红王大勇薛涵

1承德市妇幼保健院儿童医院(承德 067000)

2隆化镇医院(承德 067000)

3承德市中心医院(承德 067000)

4解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科医学部解放军耳鼻咽喉研究所(北京 100853)

据世界卫生组织（WHO）最新发布的《世界听力报告》数据显示，全球现有听力障碍4.32亿人，其中儿童约3,400万[1]。我国是世界上听力障碍人数最多的国家，其中听力障碍超过了肢体残疾、智力残疾，位于残疾人总数之首（33.51%）[2]。每年新发出生缺陷儿童中先天性听力障碍从2012年的3.5万例（3.89%）[3]上升到2019年的6～8万例[4]，已成为仅次于先天性心脏病的第二大出生缺陷。

新生儿听力筛查在发现先天性听力损失方面取得了很好的成绩，但是不能发现迟发性遗传性耳聋。因此，新生儿听力与基因联合筛查的方法应运而生[5，6]，并在以北京、天津为代表的多个省市应用[7-9]。多项研究显示新生儿听力与基因联合筛查可有效提高新生儿听力缺陷的早期检出率[10]。因此，本研究首次针对承德地区2019年4月至2021年10月间出生的25,205名新生儿进行听力与基因联合筛查，并综合分析承德地区新生儿的聋病易感基因的分子流行病学特征，全面评估河北省承德市新生儿中遗传性耳聋基因的变异频率和类型，为承德地区新生儿人群的聋病易感基因携带情况提供流行病学数据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2019年4月至2021年10月，承德市11个区（县）出生的25,205名新生儿，女12,094例，男13,111例。基因筛查前新生儿监护人均已签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 听力筛查

新生儿出生后72小时内采用耳声发射（oto-acoustic emissions，OAE）法，在新生儿自然睡眠或安静状态下，进行客观、快速和无创的听力初筛。初筛未通过者于出生后42天采用自动听性脑干诱发电位（automatic auditory brainstem response,AABR）法进行听力复筛，>20 dB nHL判定为不通过。

1.2.2 血样采集

新生儿出生后采集足跟血，在按摩或热敷新生儿足跟外侧采血部位并用75%酒精完全消毒皮肤后，使用一次性采血针刺采血部位(深度<3mm)，用干棉球拭去第1滴血，从第2滴血开始将滤纸片血圈中心与之接触并自然渗透至滤纸背面（切勿触及皮肤），如此采集至少2个血斑，自然晾干呈深褐色制成干血片。操作过程符合卫生部《新生儿疾病筛查技术规范》（2019年版），晾干过程中避免阳光及紫外线照射、烘烤、受潮以及挥发性化学物质污染。采集后的合格干血片样本单独置于封口袋内密封，2-8℃保存备用。

1.2.3 基因筛查

应用华大基因联合探针锚定聚合测序法针对遗传性耳聋相关的24基因208位点进行筛查，根据基因变异位点序列信息设计特异性扩增引物，利用多重PCR技术扩增人基因组DNA中的靶序列，并同时引入用于样本识别的样本标签序列，制备文库。采用BGISEQ-500基因测序仪对测序样本进行序列信息读取，经文库接头序列及样本标签序列比对拆分，测序样本中每一条DNA的测序结果将被精确定位到每一个样本中。测序结果使用遗传性耳聋基因分析软件（版本号:HCS-2 V1.0）进行贝叶斯定理和受试者工作特征曲线（receiver operat-ing characteristic curve，ROC曲线）进行计算分析。

1.2.4 电话随访

对常染色体隐性遗传双等位基因突变个体和常染色体显性单等位基因突变个体的监护人进行电话随访，获取新生儿相关信息，监护人自述新生儿的健康状况及听力筛查结果“通过”或“未通过”（单侧或双侧）、目前听力状况、听力损失干预情况。如果获知新生儿对声音反应不灵敏，告知其到河北省项目定点听力筛查诊治中心耳鼻喉科进行听力检测。

2 结果

2.1 联合筛查总体情况

在25,205例新生儿中，88.81%（22,385/25,205）通过联合筛查，99.32%（25,034/25,205）通过听力筛查，89.34%（22,518/25,205）通过基因筛查。10.51%（2,649/25,205）通过听力筛查，未通过基因筛查（详见表1）。基因筛查检出2,687例携带耳聋致病基因变异，携带率10.66%（2,687/25,205），其中男婴1,368例（5.43%，1,368/25,205），女婴1,319例（5.23%，1,319/25,205）。

表1 25,205例新生儿基因和听力联合筛查结果Table 1 Results of genetic screening and associations between hearing and genetic screening of 25,205 neonates

2.2 耳聋基因突变的分布

承德地区25,205例新生儿进行了遗传性耳聋相关的24基因208位点检测，共检出2,687例新生儿至少携带一种基因变异，变异携带率由高到低依次为：GJB2、SLC26A4、MT-RNR1、GJB3、TMPRSS3、USH2A、OTOF、MARVELD2、MYO15A、MYO7A、DFNA5、LRTOMT基因（详见表2）。其中，中国人群携带的聋病易感基因变异中以GJB2、SLC26A4、GJB3以及线粒体的MT-RNR1为主，这4个基因的179个位点在本研究中共发现2,634例变异，其中含一个以上突变位点的变异122例，例如：GJB2（c.109G>A）/SLC26A4（c.919-2A>G）双基因杂合突变。筛查GJB2基因的94个位点发现基因变异1,812例，总变异率为7.19%。其中，c.109G>A位点变异最多为1,127例（变异率4.47%），包括单基因纯合突变10例、单基因杂合突变1,048例，含一个以上突变位点69例。GJB2c.235delC位点变异483例（变异率1.92%），包括单基因纯合突变1例、单基因杂合突变442例，含一个以上突变位点40例；GJB2c.299_300delAT位点变异126例（变异率0.50%）均为杂合突变。GJB2基因c.109G>A位点和c.235delC位点单基因纯合的基因型受累者11例，6例通过新生儿听力筛查，5例未通过听力筛查的新生儿中2例进行了听力诊断结果未及异常，2例未进行听力诊断自述目前听力正常，1例诊断为神经性耳聋并植入人工耳蜗。

表2 2,687例变异携带者基因型Table 2 The genotype of 2,687 positively detected patients

有关Pendred综合征和大前庭水管综合征（EVA;OMIM#600791）的常染色体隐性遗传基因SLC26A4（又称PDS基因）在本研究中筛查发现562例变异，总变异率为2.23%。其中c.919-2A>G变异306例（变异率1.21%），包括单基因杂合突变266例，含一个以上突变位点40例，未通过听力筛查6例均为杂合突变；c.2168A>G变异68例（变异率0.27%），包括单基因杂合突变58例，含一个以上突变位点10例，3例未通过听力筛查的新生儿中有2例是双胞胎，经母亲基因型验证双胞胎基因型为SLC26A4基因c.2168A>G/c.281C>T复合杂合突变。与氨基糖甙类药物引起药物型耳聋有关的线粒体MT-RNR1基因变异共发现247例，总变异率为0.98%，无论均质和异质突变所有个体均受累。其中m.1095T>C变异184例，m.1555A>G变异57例，m.1494C>T变异6例，变异率分别为0.73%、0.23%和0.02%。筛查发现GJB3基因变异97例，总变异率为0.38%，其中c.538C>T变异84例（变异率0.33%），c.547G>A变异例数13例（变异率0.05%）。

除上述四个热点基因外，本研究还发现涉及眼耳两个感觉器官最常见的尤塞氏（Usher）综合征相关的USH2A基因（c.99_100insT）和MYO7A基因（c.3719G>A）单基因杂合突变携带者共11例；非综合征型耳聋相关TMPRSS3基因（c.916G>A）、OTOF基 因（c.2977_2978delAG）、MARVELD2基 因（c.858dupT）、LRTOMT基因（c.655C>T）、MYO15A基因（c.9690+1G>A）共41例单基因杂合突变携带者以及1例DFNA5基因（c.991-15_991-13delTTC）常染色体显性基因杂合突变携带者，其中TM-PRSS3基因携带者最多32例。具有迟发渐进性高频听力下降表型的DFNA5（OMIM#600994）杂合突变受累者通过了新生儿听力筛查，父母自述未进行听力诊断，至10月龄随访时尚未出现听力下降。

在承德地区的25,205例新生儿中，民族人数由多到少依次为满族、汉族、蒙古族、回族等。其中满族和汉族的阳性检出率分别为10.57%（1,927/18,224）和 11.18%（679/6,074），无统计学差异（c2=1.6779，P=0.1952）。GJB2的 c.299_300delAT突变位点在汉族和满族人群中携带率分别为0.63%和0.40%，存在统计学差异（c2=4.5909，P=0.03214）。SLC26A4的c.919-2A>G突变位点在汉族和满族人群中携带率为1.33%和0.97%，存在统计学差异（c2=5.3526，P=0.02069）。而在汉族人群未发现GJB2的c.598G>A、SLC26A4的c.1707+5G>A、c.1746delG和c.334C>T以及GJB2（c.109G>A）/TMPRSS3（c.916G>A）突变位点，在满族人群中分别筛出多于3例。

3 讨论

目前世界范围内常规使用的新生儿听力筛查基于电生理学技术，受环境因素影响大，对迟发性耳聋和药物性耳聋检出率低。自2006年，美国哈佛医学院教授Cynthia Morton提出耳聋基因筛查的倡议，截至2018年底，国内开展新生儿基因筛查超过320万，王秋菊等[11]认为将听力筛查与基因筛查联合应用在语前性听力损失、迟发性听力损失或者致聋基因的携带者，并结合定期随诊及监测，是目前最为有力的筛查策略。

本研究首次在承德市开展新生儿听力与基因联合筛查，初步获得了承德市新生儿人群遗传性耳聋的基因变异携带情况。25,205名新生儿中检测到2,687例耳聋基因变异携带者，携带检出率10.66%（2,687/25,205），显著高于北京、天津、山西、成都、武汉、珠海、广州、嘉兴、淄博等地基于芯片法检测的携带检出率4.51%、5.40%、5.15%、4.03%、3.08%、4.15%、3.68%、4.89%、4.91%[12-15,22]。国内各地新生儿耳聋基因筛查基因数、检测变异位点数虽然存在差异，但对本研究中承德地区的新生儿基因筛查数据集中与芯片法检测相同的20个位点单独统计，则携带检出率为4.94%（1,244/25,205），与上述国内各地检测携带率基本一致，由此考虑本研究发现的承德地区新生儿耳聋基因的高携带率主要是基于基因检测范围的扩大，因而发现了更多的常规筛查未能检测到的耳聋基因的变异携带状态。

本研究扩展筛查出的1,443例耳聋基因携带者中75.94%（1,095/1,442）是GJB2基因的c.109G>A位点变异。承德地区c.109G>A人群变异携带率约4.47%，符合我国汉族正常人群中携带率2.8～8.2%[15]。GJB2基因变异导致缝隙连接蛋白Con-nexin26（Cx26）的功能改变和对钾离子循环通路形成干扰，导致听力损失。GJB2基因变异为遗传性耳聋最常见的病因，有超过100个等位基因已被鉴定与耳聋有关，例如欧洲人群中GJB2c.35delG变异约3%[16]，占GJB2诱导听力损失的85%[17]；亚洲人群中c.235delC变异约2%[18,19]；在德系犹太人群中最常见的c.167delT约7%[20]。国内一项覆盖25省32个地级市的新生儿耳聋基因筛查调查中显示GJB2c.35delG在中国耳聋人群中并不常见[12]。GJB2c.109G>A变异虽然在承德地区新生儿中携带率较高，但纯合和复合杂合变异属于非截短变异，通常只影响单个或多个氨基酸，具有相对温和、外显率低的特点，约20%表现出迟发性听力损失[21]，且听力表型差异较大。承德地区1,127例c.109G>A携带者统计量提示在以往研究中，国内各地耳聋基因携带的实际情况应高于目前文献报道。向携带者及其配偶详细介绍c.109G>A变异的特点非常必要，携带者夫妇生育二胎时子代出现GJB2c.109G>A纯合变异的概率为25%。因此，对于早发现、早预防可阻止或延缓听力损失的发展来讲，社会、临床以及携带耳聋致病基因的家庭都具有非常重要的价值。

本研究新生儿听力与基因联合筛查发现的线粒体MT-RNR1基因或SLC26A4基因变异携带者共803例（3.18%，803/25,205)，其中8例未通过听力筛查。线粒体MT-RNR1基因变异为母系遗传，携带此变异患儿的母系家族成员同样是药物性耳聋敏感个体，接触极小或治疗剂量的氨基糖苷类药物亦可诱发严重听力损失。此外，线粒体基因相关的耳聋，除药物致聋表型外，也可能在无药物接触史的情况下出现成年后听力损失，作为一个单独的非综合征性耳聋类型对待。参照《遗传性耳聋基因变异筛查技术专家共识》，需要强调检出线粒体MT-RNR1基因无论是均质或异质状态，均应提示受检者的药物性耳聋风险极高，应建议其本人以及母系家系成员均应终身避免使用该类药物。SLC26A4基因突变导致的大前庭水管综合征是常染色体隐性遗传疾病，前庭水管扩大本身的特点决定了其迟发性听力损失的高发性。本研究中听力筛查未过且基因筛查确定为复合杂合突变的2例（双胞胎），回访时幼儿1岁7个月，父母自述幼儿目前听力正常，但未进一步检查颞骨CT和MRI，建议应尽早诊断是否存在内耳发育畸形。其他新生儿通过听力筛查但基因验证为复合杂合突变受累的，迟发于婴幼儿期的约70%，迟发于学龄前期及学龄期的约30%[21]，因此应高度警惕基因型受累者在未来成长阶段因轻度颅脑外伤、剧烈运动或者感冒等造成的听力下降。

非综合征型常染色体显性遗传模式(DFNA)的听力损失是迟发性听力损失最为常见的临床表型，本研究中筛查发现1例DFNA5正是这一遗传模式里第五个被定位的基因。DFNA5共有10个外显子，其第7内含子的3碱基对缺失（c.991-15_991-13delTTC）导致第8外显子转录缺失，截短所翻译的蛋白最终致聋。DFNA5表型多为渐进性的感音神经性听力损失，同家系受累成员的听力下降曲线图类似，发病年龄可延迟到40岁。这一DFNA5受累者的发现说明基因筛查的检测基因数和位点数的扩展不仅可以对人群携带率有更准确的评估，还可以对各类型迟发性听力损失做到应筛尽筛。对于明确常染色体显性遗传模式的受累者及其父母应进行必要的遗传咨询，建议在生育二胎之前先进行耳聋基因检查，在婚配和生育时也需要明确其配偶耳聋基因携带情况，必要时要进行产前诊断及干预。

承德地区的汉族和满族的新生儿人群中GJB2（c.299_300delAT和 c.598G>A）、SLC26A4（c.919-2A>G、c.1707+5G>A、c.1746delG 和 c.334C>T）和GJB2（c.109G>A）/TMPRSS3（c.916G>A）等突变位点具有不同的等位基因频率，在阳性检出率无显著差异的情况下，承德地区汉族和满族常见耳聋基因突变存在异同。

针对43例基因型受累/复合杂合携带者追踪回访，其中26例初始听力筛查通过且目前听力正常，其余17例初始听力筛查未过的新生儿中5例已通过听力诊断，8例未进行听力诊断自述目前听力正常，4例在早期（<2岁）出现了听力损失并确诊，其中3例神经性耳聋已植入人工耳蜗。虽然基因筛查加速了遗传性听力损失高风险患儿的识别与耳聋患者的早期诊断，但是迟发性听力损失是在成长发育过程中出现的，儿童3-6岁学龄前期是语言学习和认知能力发育的重要时期，听力损失发生于该阶段会严重影响儿童的语言发育、学习能力及社交、心理发育。因此下一步应加强承德地区宣教、婚前孕前遗传咨询、完善耳聋基因筛查随访体系，尽早明确听力损失的遗传病因，做到精准个性化干预康复。同时，下一步临床建议增加孕前对育龄夫妇的产前筛查，配合耳聋基因的遗传咨询，预防先天性耳聋的发生。对于听神经、听觉传导通路以及听觉语言中枢基本是正常的先天性和迟发性听力损失，及时佩戴助听器或是植入人工耳蜗都可以获得良好的效果。

综上，承德市聋病易感基因分子流行病学研究可以发现迟发性和药物性聋，这些携带者不易在婴儿阶段观察到临床表型，更需要在今后的耳聋出生缺陷防控工作中加强家庭养护方面的健康教育和科普，对携带致病基因的人群在婚前、孕前充分遗传指导及耳毒性药物的合理使用，减少和有效推迟耳聋发生。

致谢：感谢王晓玲和尹琳微对本文内容所做的补充、修改，感谢艾雪、马国静对本项目数据进行的收集与整理。