芍药组培丛生芽增殖及生根技术的优化

孙晓梅，张晓菊，裴新辉，霍丽茹，刘雪婷，宋曜红

（1.沈阳农业大学 林学院/辽宁省林木遗传育种与培育重点实验室，沈阳 110161；2.辽宁省农业科学院花卉研究所，沈阳 110161）

芍药（

Paeonia lactiflora

）为芍药科芍药属多年生宿根草本植物，是我国传统名花之一，距今已有4000年的栽培历史，对我国赏花文化的形成起着重要推动作用。芍药也具有很高的经济价值，种子可榨油，根部（白芍）可入药，有收敛止血、缓中止痛等功效。长期以来，芍药的繁殖主要采用分株繁殖和种子繁殖两种方式。芍药分株易受季节限制、繁殖系数低，而芍药种子具有上下胚轴双重休眠的特性，自然条件下，需2年的时间萌发，此后还需2~3年生长才能开花，繁殖周期过长，影响栽培育种工作。目前，分株繁殖和种子繁殖方式不能满足芍药商品苗规范化、规模化生产的需求，阻碍芍药的商业化发展。

植物组织培养技术具有繁殖速度快、增殖系数高、遗传稳定性强等优点，利用组织培养技术进行种苗生产是观赏植物产业发展的必然趋势。虽然前人对芍药组织培养在外植体的选择、外植体的消毒、丛生芽途径、愈伤组织途径、体细胞胚途径等方面进行了大量的研究，但芍药再生体系的建立长期未取得突破性进展，组织培养过程中存在种胚萌发整齐度差、组培苗增殖率低、生根质量差、褐化等问题。本研究以芍药种子为研究对象，通过筛选培养基、接种方式、植物激素配比、培养环境等手段，进行种胚萌发、丛生芽诱导、腋芽增殖、组培苗生根的研究，以期提高种胚繁殖效率，并解决培养过程中的褐化难题，建立高效的芍药种胚再生体系，加快芍药组织培养的商业化进程。

1 材料与方法

1.1 材料与培养条件

本试验采用的‘粉玉奴’ב粉玉楼’杂交种子，来自沈阳农业大学芍药种质资源圃，于2019年采集种子，阴干后于4℃冰箱中保存备用。

本试验采用培养基种类有1/2MS、MS、WPM，蔗糖浓度为30g·L，琼脂粉浓度为6.5g·L，培养基pH值为5.8；组织培养室光照时间为16h·d，光照强度2000~3000lx，温度为24~26℃。

1.2 方法

1.2.1 切割方式影响种胚萌发试验 将芍药种子置于无菌水中浸泡48h，剥去外层种皮，放入超净工作台上用75%酒精消毒30s后，倒入0.1%HgCl进行消毒，消毒时间为5min，再用无菌水冲洗3~5次。使用3种切割方式（传统切割、只留胚切割、半保留胚乳切割）进行切割（表1），将不同处理后的种胚接种至培养基中，培养基选用MS+0.5mg·LGA+1.0mg·L6-BA。30d后统计不同切割方式下种胚的萌发率、污染率、死亡率。

表1 芍药种胚培养的不同切割方式
Table 1 Different cutting methonds for embryo culture

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1.2.2 丛生芽诱导基本培养基筛选试验 选取已萌发20~30d的胚苗，将胚苗接种至1/2MS、MS、WPM 3种基本培养基，GA浓度为1.0mg·L、6-BA浓度为1.0mg·L，每个处理10瓶，每瓶接5个外植体，重复3次，30d后观察芽苗生长状态，筛选出丛生芽诱导最佳培养基。

1.2.3 切除子叶诱导丛生芽试验 选取萌发20~30d胚苗切割子叶，转接到WPM+0.5mg·L6-BA培养基诱导丛生芽，设置不切割子叶的胚苗做对照组，30d后观察丛生苗的褐化、丛生芽诱导情况。

1.2.4 预处理对腋芽褐化现象减轻试验 将腋芽从诱导出的丛生苗上取下，进行预处理（光照处理16h·d、暗培养24h·d），每种处理设置两种培养基（1/2MS和1/2MS+3.0g·LAC）。预处理5d后将腋芽转接到增殖培养基（WPM+0.5mg·LGA+1.0mg·L6-BA）中诱导腋芽增殖，并设置不经过预处理的腋芽（CK）做对照组，20d后统计腋芽褐化率。

1.2.5 6-BA、TDZ、GA诱导腋芽增殖试验 将经过预处理的腋芽（暗处理5d、培养基：1/2MS+3.0g·LAC），转接到WPM培养基中，并分别添加不同浓度的6-BA（0.3，0.6，1.0mg·L）、TDZ（0.3，0.6，1.0mg·L）、GA（0.3，0.6，1.0mg·L），先进行5d暗处理，然后转移到正常光照条件下培养。每个处理7瓶，每瓶接种4个外植体，重复3次，30d后观察腋芽的生长、增殖状态及褐化情况。

1.2.6 丛生苗生根最佳AC浓度的筛选 选用增殖60d的丛生苗，分别转接到添加AC（0，1.0，2.0，3.0，4.0g·L）的培养基中，45d后观察丛生苗的根部生长状态。

1.2.7 诱导丛生苗生根最佳激素筛选 选用增殖60d的丛生苗，转接到添加不同浓度IAA（0，0.5，1.0mg·L）、IBA（0，0.5，1.0mg·L）的1/2MS+3.0g·LAC培养基上，45d后观察生根情况。

1.3 数据处理

采用SPSS20.0软件对试验数据进行One-Way ANOVA分析，并利用LSD法检验差异显著性（

p

≤0.05）。

2 结果与分析

2.1 芍药种胚的启动培养

由表2可知，启动培养30d后，萌发率最高的接种方式是半保留胚乳接种，萌发率达93.41%，显著高于传统接种（74.42%）和胚接种（77.21%）；在污染率方面，传统接种污染率最高，为10.79%，只留种胚的接种方式污染率为3.31%；在成苗率方面，半保留胚乳接种成苗率为85.45%，显著高于其他两种接种方式；只留胚的接种方式萌发速度最快，平均5~7d可以看到胚苗生长明显，但这种方式成苗率（71.17%）和萌发率（77.21%）低，因为在取种胚的过程中伤害到胚，致使胚畸形生长，不能发育成苗。综上，半保留胚乳接种方式优于传统接种和只留胚接种。

表2 切割方式对芍药种胚萌发的影响
Table 2 Effects of cutting mode on seed embryo germination

注：同一列数字后的不同小写字母表示0.05水平差异显著，数据=平均值+标准偏差。下同。
Note:Differentuppercaselettersafter thesamecolumnnumber indicatesignificantdifferenceat0.05level.Data=mean+standard deviation.Thesamebelow.

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2.2 芍药丛生芽增殖培养

2.2.1 不同基本培养基对丛生芽诱导的影响 由图1和表3可知，丛生芽诱导30d后，WPM培养基丛生芽诱导率最高为92.67%，其次是MS培养基，丛生芽诱导率为86.67%，1/2MS培养基丛生芽诱导率最低，为73.33%；从抽芽率情况来看，WPM培养基诱导丛生芽的芽丛数最多，为2~5丛，MS培养基诱导丛生芽的芽丛数最少，为1~2丛；从芽苗生长状态来看，1/2MS和MS培养基诱导的丛生芽整体淡黄绿色，抽芽不均或抽芽少，WPM培养基诱导的丛生芽整体浓绿，株型紧凑，抽芽多。综上表明，基本培养基种类对芍药丛生芽诱导率有显著影响，对丛生苗生长状态也有一定的影响，最适合丛生芽诱导的培养基为WPM培养基。

图1 1/2MS、MS、WPM培养基诱导芍药丛生苗对比Figure 1 1/2MS，MS and WPM medium-induced Paeonia lactiflora clumped seedlings comparison

表3 不同培养基种类对芍药丛生芽诱导的影响
Table 3 Effects of different medium species on the induction of buds

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2.2.2 切除子叶对丛生芽诱导及褐化的影响 由表4可知，切除子叶时丛生芽诱导率和褐化率均高于未切除子叶，二者诱导率分别为99.33%和67.33%。在切除子叶后3~5d，可明显观察到子叶间萌发出芽点，未切除子叶的组培苗则需要10d观察到芽点。且切除子叶时组培苗诱导丛生芽数量同样多于未切除子叶（图2）。综上，切除子叶更有利于丛生芽的诱导。

表4 切除子叶对芍药丛生芽诱导率及褐化率的影响
Table 4 Effects of cotyledon excision on induction rate of cluster buds

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图2 切除子叶芍药丛生芽诱导对比Figure 2 Comparison of bud induction of excised cotyledon Paeonia lactiflora cluster

2.2.3 预处理对腋芽褐化的影响 由表5可知，在相同光照条件下，A2处理的褐化率显著低于A1处理，A4处理的褐化率显著低于A3处理，说明在预处理培养基中加入3.0g·LAC有降低腋芽褐化率的作用。相同活性炭浓度预处理，A4处理腋芽褐化率显著低于A2处理，暗培养可减轻腋芽的褐化。A1处理的褐化率显著低于对照组，说明转接可以有效地降低褐化率。综上，腋芽增殖培养前在含有3.0g·LAC培养基上进行5d的暗培养预处理，能够有效降低转接后的褐化率，且转接能够有效改善褐化。

表5 预处理对芍药腋芽褐化的影响
Table 5 Effects of pretreatment on browning of axillary bud

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2.2.4 外源生长调节物质对腋芽增殖的影响

2.2.4.1 6-BA对腋芽增殖的影响 由表6和图3可知，在浓度为0.6mg·L6-BA的培养基中，腋芽生长状态最好，基部分化出新的丛生芽生长点，每丛真叶数4~6片，此时褐化率为51.19%；在后续继代培养中，添加1.0mg·L6-BA的培养基内腋芽基部形成愈伤组织，腋芽停止分化，叶片生长不良。

图3 3种6-BA浓度下芍药腋芽生长状态Figure 3 Growth status of Paeonia lactiflora axillary buds under three 6-BA concentrations

表6 6-BA浓度对诱导芍药腋芽增殖的影响
Table 6 Effects of 6-BA concentration on induction of axillary proliferation

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2.2.4.2 TDZ 对腋芽增殖的影响 由表7和图4可知，添加TDZ的培养基中，腋芽整体基部膨大，真叶叶柄短粗或少有叶片，叶片高度在1~3.5cm。TDZ浓度越高，叶片生长情况越差，TDZ浓度达到1.0时，叶片扭曲变形，无法正常生长。

表7 TDZ浓度对诱导芍药腋芽增殖的影响
Table 7 Effects of TDZ concentration on induction of axillary proliferation

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图4 3种TDZ浓度下芍药腋芽生长状态Figure 4 Growth status of Paeonia lactiflora axillary buds under three TDZ concentrations

2.2.4.3 GA对腋芽增殖的影响 由图5和表8可知，随着GA浓度的增长，诱导出的丛生芽丛数增加，但同时导致叶片变小畸形、叶柄黄化、玻璃化等现象。GA浓度为0.3mg·L时，真叶嫩绿色，健康生长，长7mm；当GA浓度达到1.0mg·L时，叶柄细弱，呈嫩黄色透明状，继代培养后无法输送营养物质，最终萎蔫。

表8 GA 浓度对诱导芍药腋芽增殖的影响
Table 8 Effects of GA concentration on induction of axillary proliferation

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图5 3种GA 3浓度下腋芽生长状态Figure 5 Growth status of Paeonia lactiflora axillary buds under three GA 3 concentrations

2.3 丛生苗生根

2.3.1 AC浓度对丛生苗生根的影响 由表9可知，培养基中添加AC的处理，其生根率显著高于未添加AC的处理。AC的浓度为3.0g·L时，丛生苗的生根率最高，达到80.00%，且此时丛生苗生根状态最好，根系覆盖度广。

表9 AC浓度对芍药丛生苗生根的影响
Table 9 Effects of AC concentration on rooting of cluster seedlings

注：+表示生根量少；++表示2～3条侧根，平均长度1.0～2.0cm；+++表示2～3条侧根，平均长度1.5～3.5cm；++++表示4条及以上侧根，平均长度
1.5～3.5cm。
Note:+means less rooting;++represents 2-3 lateral roots with an average length of 1.0-2.0 cm;+++represents 2-3 lateral roots with an averagelength of 1.5-3.5 cm;++++represents4 or morelateral roots with an averagelength of 1.5-3.5 cm.

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2.3.2 生长素浓度及种类对丛生苗生根的影响 由图6和表10可知，C2处理生根率最高，达到69.38%，该培养基中的不定根状态最好，根系数量多覆盖面积大；C1处理的丛生苗侧根短小，数量少；在相同生长素浓度下，IBA的生根诱导率高于IAA，但IAA的褐化率低于IBA；C3处理生根率最低，仅为38.29%，且只有主根伸长生长，未萌发出侧根；同为IAA浓度1.0mg·L时，对比C5处理、C6处理的生根率、褐化率，发现IBA浓度越高生根率越高，褐化率也随之增高。综上，添加1.0mg·LIBA可以有效诱导出不定根，IAA的诱导生根效果不明显。1/2MS+1.0mg·LIBA+3.0g·LAC是最适宜诱导丛生苗生根的培养基。

表10 生长素对芍药丛生苗生根及褐化的影响
Table 10 Effects of auxin on rooting of clustered shoots and browning

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图6 不同生长素芍药丛生苗的生长状态Figure 6 Growth status of Paeonia lactiflora clustered seedlings under different auxin treatments

3 讨论与结论

胚乳组织导致休眠是许多双子叶植物种子的主要休眠类型。芍药种胚通常需要6-BA、GA等打破休眠。前人研究发现，芍药种子外种皮和胚乳阻碍胚吸收培养基中营养成分，影响了培养基中激素的作用，胚乳中也可能含有对种胚的生长起阻碍作用的某种抑制成分。本研究结论与前人大致相同，胚接种萌发快、污染率低，萌发成功的胚有部分畸形不能成苗；传统接种萌发时间分散；去除种皮、保留小部分胚乳并露出部分的胚是最好的外植体处理方式，萌发集中，成苗率高。

增殖培养是为保证丛生苗隐芽、腋芽以及不定芽的分化和生长，将芍药丛生苗上的腋芽分割，继代培养可扩大芍药组培苗增殖系数。前人研究发现不同品种的牡丹适合不同的基本培养基。本试验发现，‘粉玉奴×粉玉楼’杂交组培苗在1/2MS、MS、WPM培养基上表现不同，WPM诱导的丛生苗子叶短小，丛生芽多，真叶短粗健康，最适合进行丛生芽诱导。且子叶损伤的胚苗更易诱导出丛生芽。据观察，腋芽增殖过程中，褐化反应剧烈，未经处理的腋芽有80%会在继代的15d内褐化并死亡。前人研究发现，活性炭对褐化有一定的控制作用，且外源生长调节物质对腋芽的生长发育起决定性作用。本试验研究结论与前人相似，认为AC、暗培养、转接能够有效地降低褐化率；6-BA对腋芽的生长有重要作用，可以使真叶健康生长，诱导出新的生长点；GA可促进芽的诱导，低浓度的GA处理下真叶生长良好，高浓度的GA会引起腋芽的玻璃化，这与蔡葛平的结论相似。本研究发现，腋芽对激素浓度变化的比丛生苗更为敏感，需要继续探讨更低浓度的激素组合，尤其是TDZ和GA，也可通过提高培养基硬度、添加AC、改变光照环境等，减轻高浓度GA带来的玻璃化问题。

生长素是诱导芍药组培苗生根的重要因素，目前芍药组培苗常使用的是IBA、NAA、IAA，但NAA诱导的根是愈伤分化而来，与苗连接不紧密，不适宜移栽。前人研究牡丹时发现，IBA和AC配合使用是牡丹组培苗最有效的生根方法。本研究发现，生长素与AC的配合使用，也是芍药组培苗最有效的生根方法。添加AC的生根苗，根部为白色有韧性的须根，这可能是因为AC为组培苗根部的生长，营造了与自然生长相似的黑暗环境，添加AC的生根苗更适合进行下一步的壮苗移栽。在添加AC的培养基中，IAA或IBA的浓度低于1.0mg·L时，诱导生根效果都不佳；IBA诱导的根细长有侧根，IAA诱导的主根细长，不易长侧根。

芍药组织培养技术经过20多年的研究，在外植体的选择与处理、丛生芽的诱导、愈伤组织的诱导等方面取得了诸多进展，但目前的芍药种胚再生技术没有达到扩大繁殖率和组培苗出瓶、移栽的程度，从而无法构建完整的转基因体系。本研究在完善了芍药丛生芽诱导途径步骤之外，同时研究了腋芽的增殖培养，下一步应着重解决腋芽的生根问题，实现芍药丛生芽再生。