基于表型性状的西伯利亚杏核心种质构建

孙永强，陈建华，张 剑，董胜君，刘权钢，刘青柏

（沈阳农业大学林学院，沈阳 110161）

西伯利亚杏（

Armeniaca sibirica

）为蔷薇科（Rosaceae）杏属（

Armeniaca

）植物，是我国干旱半干旱地区重要的生态经济型树种，集中分布于我国内蒙古、辽宁和河北等地。西伯利亚杏果实、果核、果仁具有较高的经济价值，在食品、医药及工业等领域具有巨大开发潜力，是林农脱贫致富的重要产业。目前，抗寒西伯利亚杏品种匮乏，幼果期冻害导致的减产绝收严重制约了产业健康发展。开展西伯利亚杏种质资源的评价，是培育幼果抗冻良种的基础。西伯利亚杏野生种质资源丰富，为育种研究提供了重要亲本材料。本课题组历经20余年时间，对国内外14个种源地的西伯利亚杏种质资源进行了系统的调查和收集，并将初选种质经过无性系化，异地保存于山杏国家林木种质资源保存库，同时对西伯利亚杏种质资源开展了引种适应性、抗逆性、遗传多样性等相关研究。

植物育种成效跟植物种质资源的数量有着不可分割的关系，因此种质资源的调查、收集和保存工作已引起世界各国高度重视，但种质资源收集数量的庞大不利于种质资源的保存及利用。FRANKEL于1984年提出的核心种质概念有效的解决了此问题。随后，多个学者就其基本特征、构建原理、方法和步骤等方面作了进一步论述。核心种质以最小的材料数量最大程度代表全部种质的遗传多样性，既有助于挖掘优良基因，又利于提高种质资源利用效率，已逐渐成为国际种质资源研究的热点。目前，构建核心种质的数据类型多数为表型性状数据和分子标记数据，如刘娟等利用35个表型数据从135份新疆野杏中选出33份核心种质；章秋平等利用国家果树熊岳李杏圃中的447份普通杏基于表型数据构建了核心种质；ZHANG等利用16对ISSR引物构建了19份仁用杏微核心种质；MAHMOODI等利用表型数据构建了核桃楸的核心种质；李洪果等基于SSR分子标记数据从887份杜仲中选出189份核心种质。也有学者整合表型和分子标记数据后构建核心种质，如WANG等整合表型和分子标记数据后，从1501份普通杏中选出150份核心种质；李金龙等利用6个表型性状和7对SSR分子标记，构建了530份甜荞初级核心种质；WANG等利用18个表型性状数据和10对SRAP分子标记数据获得234份核心种质。近几年，我国陆续构建了毛白杨、云南核桃、樟树、传统菊花等木本植物核心种质库，为其种质资源保护和利用奠定基础，但在西伯利亚杏上未见相关报道。本研究利用201份西伯利亚杏种质资源的21个质量性状和24个数量性状，探讨了西伯利亚杏表型核心种质的构建，以期为西伯利亚杏种质资源的科学管理，精细评价和高效利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料来自于沈阳农业大学—喀左县山杏国家林木种质资源保存库的201个西伯利亚杏无性系（表1），保存库采用完全随机区组设计，共4个区组，每个无性系每个区组栽植10~15株。种源分别为辽宁喀左县（22份）、辽宁北票市（22份）、辽宁朝阳县（10份）、内蒙古敖汉旗（13份）、内蒙古扎兰屯市（62份）、吉林敦化市3份、吉林吉林市（2份）、吉林通榆县（2份）、山西省盂县（5份）、河北围场县（17份）、河北滦平县（10份）、河北涿鹿县（16份）、北京延庆区（3份）、俄罗斯外贝加尔边疆区（14份）。

表1 供试西伯利亚杏无性系概况
Table 1 The clones for tested materials

?

1.2 表型性状调查

表型性状于2016～2020年进行连续观测，每个区组每个无性系调查3株。调查内容包含枝、叶、果实、果核、果仁等指标，共计24个数量性状和21个质量性状。质量性状调查以《山杏种质资源调查及评价技术规程》为参考依据，补充部分表现型（表2）。数量性状调查如下。

表2 西伯利亚杏种质资源质量性状，记载标准及频率分布
Table 2 Descriptive phenotypic traits,recorded standard and frequency distribution of resources

注：*代表补充的表现型；括号内数据表示在201份样本中所占比例。
Note:*Represents thephenotypeof optimization supplement;Thedata in bracketsrepresent theproportion of the 201 samples.

?

枝、叶：于每年9～10月份调查。选取当年生枝条、测量小枝长度、小枝粗度、叶片长度、叶片宽度、叶柄长度、计算叶形指数（叶长/叶宽）。

果实、果核、果仁：于每年6～7月果实成熟期调查。于每树冠4个方向采摘20～30个发育良好的果实，测量果实纵径、果实横径、果实侧径、单果重、果核纵径、果核横径、果核侧径、核壳厚度、单核重、果仁纵径、果仁横径、果仁侧径及单仁重、计算果形指数（果实纵径/果实横径）、核形指数（果核纵径/果核横径）、仁形指数（果仁纵径/果仁横径）、出核率（单核重/单果重）、出仁率（单仁重/单核重）。

1.3 核心种质的构建策略

1.3.1 不分组整体取样 基于逐步聚类法，以25%的取样比例为例，将2种遗传距离（欧式距离和马氏距离），6种聚类方法（UPGMA、WPGMA、可变类平均法、离差平方和法、最短距离法和最长距离法）和3种取样方法（随机取样法、优先取样法和偏离度取样法）进行组合，共36个构建策略，筛选出最佳构建策略。基于最佳构建策略，分别按照7种总体取样比例（15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%）构建出7个核心种质，根据各核心种质的遗传多样性的保留率，筛选出最佳总体取样比例。

1.3.2 分组取样 按照地理来源将西伯利亚杏分为14组，采用上述筛选出的最佳取样策略和总体取样比例，在分组前提下，选择简单比例法，对数比例法和平方根比例法对组内取样比例进行筛选。各计算公式为：

式中：

P

代表简单比例法；

L

代表对数比例法；

S

代表平方根比例法；

X

代表原种质第

i

组西伯利亚杏无性系数目。

1.4 初级核心种质的代表性评价及确认

采用均值差异百分率、方差差异百分率、极差符合率、变异系数变化率、表型保留比例和多样性指数6个参数筛选核心种质，各计算公式参照刘娟等。筛选原则为均值差异百分率小于20%，同时极差符合率大于80%，且均值差异百分率越小，方差差异百分率、极差符合率、变异系数变化率、表型保留比例和多样性指数越大，核心种质越能代表原群体。采用均值、方差、变异系数等参数并结合

t

检验和

F

检验检验最优核心种质的代表性，通过基于主成分分析的样品分布图对最优核心种质的有效性进行确认。

1.5 数据处理

对西伯利亚杏的质量性状按照《山杏种质资源调查及评价技术规程》进行赋值；对数量性状的基本分析采用4年平均值，在计算表型性状的多样性指数、保留比例以及综合运用质量性状和数量性状对种质进行聚类时，数量性状依均值和标准差分级，进行质量化处理，1级级中间每级差0.5

σ

，

k

=0，1，2。采用Excel 2019对数据进行统计和整理，并计算最大值、最小值、均值、变异系数和Shannon-weaver多样性指数和评价参数，通过DNP7.05软件进行聚类分析，

F

检验、

t

检验和主成分分析在SPSS19.0中完成。

2 结果与分析

2.1 构建策略的筛选

由表3可知，优先取样法构建的12个核心种质极差符合率均为100%，方差差异百分率均大于37.5%，变异系数变化率均大于121.99%。随机取样法构建的12个核心种质极差符合率均小于97.83%，方差差异百分率均小于29.17%，变异系数变化率均小于118.14%；同时采用同一遗传距离和聚类方法，优先取样法构建的核心种质具有更高的方差差异百分率、变异系数变化率、表型保留比例和多样性指数。偏离度取样法结合马氏距离构建的6个核心种质的均值差异百分率均大于20%，构建效果最差，其参数也都小于优先取样法。因此，优先取样法更适合构建西伯利亚杏核心种质。

表3 西伯利亚杏的36个初级核心种质与原种质性状差异百分比
Table 3 Percentage of the trait differences between the 36 core collections and initial collection of

注：D1.欧式距离；D2.马氏距离；S1.随机取样法；S2.偏离度取样法；S3.优先取样法；C1.UPGMA；C2.WPGMA；C3.可变类平均法；C4.离差平方和法；C5.最短距离法；C6.最长距离法。下同。
Note:D1.Euclidean distance;D2.Mahalanobis distance;S1.Random sampling method;S2.Deviation sampling method;S3.Preferred sampling method;C1.Unweighted pair-group average method;C2.Weighted pair-group average method;C3.Average linkage method;C4.Ward′s method;C5.Single linkagemethod;C6.Complete linkagemethod.Thesamebelow.

?

在优先取样法下，欧式距离和马氏距离构建的核心种质均值差异百分率均小于20%。马氏距离构建的核心种质D2C1S3和D2C5S3具有最大的方差差异百分率（54.17%），欧式距离构建的核心种质D1C2S3和D1C6S3次之（50%），但核心种质D1C2S3和D1C6S3具有较大的变异系数变化率（125.48%和125.32%）。此外，欧式距离构建的其他4个核心种质变异系数变化率、表型保留比例和多样性指数在同一聚类方法下均表现为欧式距离大于马氏距离。因此，欧式距离略优于马氏距离，更适合构建西伯利亚杏核心种质。

在优先取样法下，采用欧式距离、WPGMA（C2）和最长距离法（C6）构建的核心种质具有最大的方差差异百分率（50%），最长距离法（C6）拥有最大的变异系数变化率（125.48%）和最大的表型多样性指数（1.441），最长距离法略优。因此，在不分组前提下，“优先取样法+欧式距离+最长距离法”是构建西伯利亚杏核心种质的最佳组合。

2.2 总体取样比例筛选

由表4可知，7个核心种质的均值差异百分率均小于20%，极差符合率均为100%。，取样比例30%、40%、45%构建的核心种质的方差差异百分率较低，均小于25%，代表性较弱；取样比例15%、20%、25%和35%构建的核心种质方差差异百分率均在41.67%以上，变异系数变化率均大于118.80%，说明4个取样比例构建的核心种质较好地保存了原种质的遗传变异和多样性。其中，取样比例为15%时，虽然具有最大的方差差异百分率和变异系数变化率，但其表型保留比例仅为94.65%，表明表现型丢失较多；取样比例为20%时，表型保留比例和遗传多样性指数略低于取样比例为25%和35%构建的核心种质，但其方差差异百分率和变异系数变化率明显高于取样比例25%和35%。因此，选择总体取样比例20%作为构建西伯利亚杏核心种质的最佳取样比例。

表4 7种取样比例下西伯利亚杏的核心种质与原种质性状差异百分比
Table 4 Percentage of the trait differences between the core collections and initial collection at seven sampling sizes of

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2.3 分组与不分组取样比较

比较分组和不分组构建的核心种质（表5），核心种质D1C6S3采用不分组取样策略，其方差差异百分率、变异系数变化率、极差符合率、表型保留比例和多样性指数评价参数均明显大于分组构建的核心种质。因此，根据材料地理来源分组取样较不分组取样会遗漏更多的表现型，不予采纳此方法。综上所述，基于表型数据，本研究采用不分组整体取样策略进行西伯利亚杏的核心种质构建，最佳构建策略为“欧式距离+最长距离+优先取样法+20%”，核心种质D1C6S3-20是最优核心种质。

表5 分组与不分组取样下西伯利亚杏的核心种质与原种质性状差异百分比
Table 5 Percentage of the trait differences between core and initial collection constructed by grouped and no grouping sampling of

注：S为平方根比例法；L为对数比例法；P为简单比例法。
Note:Sissquareroot ratiomethod;L islogarithm ratiomethod;Pis proportion ratiomethod.

?

2.4 基于表型数据构建西伯利亚杏最优核心种质的评价

2.4.1 质量性状评价 通过比较核心种质D1C6S3-20与原种质中各质量性状表现型个数的一致性，来评价核心种质。由图1可知，21个质量性状中，仅“小枝颜色”丢失“绿色”表现型，该表现型在原种质中仅有2份，其余20个性状表现型个数与原种质一致，保留比例达98.53%，较好的代表了原始种质。

图1 西伯利亚杏的核心种质与原种质质量性状表型保留比较Figure 1 Comparison of the phenotype reservations of core and initial collection of A.sibirica in qualitative traits

2.4.2 数量性状评价 通过比较核心种质D1C6S3-20与原种质中数量性状10个分级的一致性，来进一步评价核心种质（图2）。原种质中24个数量性状共231个分级，“叶柄长度”等7个性状各丢失1~2个分级，其余17个数量性状分级个数与原种质一致，保留比例达96.54%，也较好的代表了原始种质。

图2 西伯利亚杏的核心种质与原种质数量性状表型保留比较Figure 2 Comparison of the phenotype reservations of core and initial collection of A.sibirica in quantitative traits

由表6可知，核心种质的均值多数略大于原种质，变异系数均大于原种质；

F

检验结果表明，除小枝长度等7个性状外，核心种质其余性状的方差显著大于原种质（

p

<0.05）；

t

检验结果表明，除出核率外，核心种质各性状均值与原种质无显著性差异，具有很好的代表性，可优先应用核心种质。

表6 西伯利亚杏的原种质和核心种质表型多样性与检验
Table 6 Genetic diversity andtest in phenotypic traits of initial and core collections of

注：*表示核心种质与原种质间方差在0.05水平上差异显著。
Note：*indicated that the variance between core and initial collection was significantly different at the level of 0.05.

?

2.5 基于表型数据构建西伯利亚杏核心种质的确认

主成分分析结果表明（表7），原种质和核心种质均有13个主成分入选，核心种质的各主成分贡献率均比原种质高，13个主成分累计贡献率分别为73.60%和84.00%，表明核心种质能够排除遗传冗余，提高累积贡献率。根据主成分分析，样本散点分布图表明原种质主要集中在散点图中部（图3），多份种质相互重叠，表明这一区域各种质间遗传相似度较高，遗传冗余程度高；核心种质保留了原种质的分布特征，明显降低了种质间相互重叠的程度，且较多外围个体入选，表明所选核心种质即避免了种质冗余，又确保了其代表性。

图3 基于优先取样法，采用欧式距离和最长距离法构建的西伯利亚杏的核心种质与原种质主成分图Figure 3 Principal component plots of core collection and initial collection of A.sibirica,in which core collection were constructed by euclidean distance and combining with complete linkage method based on preferred sampling method

表7 西伯利亚杏的原种质和核心种质主成分分析的特征值和累积贡献率
Table 7 Eigen value and cumulative contribution for the initial collection and the core collection of

?

2.6 基于表型数据构建的西伯利亚杏核心种质的补充优化

本研究构建的核心种质D1C6S3-20共40份，就地理分布而言，仅吉林敦化市，通榆县和吉林市的种质没有入选，原种质中3个地区的种质数量很少，分别仅有3，2，2份，各无性系不存在表型极值，可从3个地区中分别随机抽取一份进入核心种质中。对于质量性状，表型核心种质仅遗漏1个表现型，直接将具有漏选的表现型的个体补充到核心种质库。21个质量性状中，小枝颜色丢失“绿色”，341号和345号两个无性系的小枝为绿色，故随机抽取一份进入核心种质。数量性状受环境影响较大，因此暂不考虑补充修正。综上，基于表型数据，在不分组的前提下，采用最佳构建策略“欧式距离+最长距离+优先取样法+20%”构建了西伯利亚杏核心种质，经过补充优化，最终得到44份核心种质（表8）。

表8 基于表型性状构建的西伯利亚杏核心种质
Table 8 Core collection of based on phenotypic traits

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3 讨论与结论

取样方法是影响核心种质构建结果的重要环节，良好的取样方法不仅能去除原种质的遗传冗余，而且能最大限度的保留其遗传多样性。目前，多数研究者采用多次聚类结合随机取样，优先取样和偏离度取样的分析方法，3种方法分别在保留原群体的多样性形式，变异程度和遗传结构方面各具优势。张欢等研究结果表明，优先取样法构建水青叶核心种质效果最好。刘遵春等在新疆野苹果上的研究表明，偏离度取样法和优先取样法均适于新疆野苹果核心种质的构建，但优先取样法能优先保留具有极端性状的个体，能有效的保存优异基因，略优于偏离度取样法。郑福顺等对宁夏番茄的研究表明，优先取样法构建的核心种质获得了更大的遗传变异更适用于宁夏番茄核心种质的构建。本研究对3种取样方法构建的36个核心种质进行了比较，优先取样法构建效果明显优于随机取样法和偏离度取样法。

基于表型数据构建核心种质时，欧式距离和马氏距离是最常用的遗传距离。不同性状间的相关性及性状间的量纲不同往往影响着欧式距离的计算，而马氏距离与不同性状的测量单位无关，不受量纲的影响。表型数据分数量性状数据和质量性状数据，构建核心种质时可将数量性状数据进行标准化进而排除不同量纲的影响，这种处理方式已在豌豆、毛花猕猴桃、白桦等植物上得到应用，并均得出采用欧式距离构建的核心种质优于马氏距离的结论。综合运用质量性状和数量性状数据构建核心种质时，常将数量性状数据分级处理进行标准化，与质量性状重新组合后进行聚类，采用这种处理方法结合欧式距离构建了甜瓜、辣椒等农作物的核心种质，并得到较好的构建效果。本研究综合运用24个数量性状和21个质量性状构建西伯利亚杏核心种质，结果表明欧式距离构建的核心种质各项参数略优于马氏距离。

不同的聚类方法将植物分为不同的组，进而影响核心种质的代表性，因此聚类方法也是一个研究热点。李萌等采用8种聚类方法构建高粱地方品种核心种质，结果表明最长距离法构建效果优于其他7种。郎彬彬等研究结果表明，类平均法是构建毛花猕猴桃核心种质效果最佳。在本研究中，比较了6种聚类方法的构建效果，发现最长距离法构建效果具有最高的变异系数变化率和表型多样性指数，构建效果最好。

取样比例是衡量核心种质是否有效的另一个重要环节。有学者认为原种质资源相对较少时，取样比例变化的幅度较大，当资源达到一定量时，其取样比例随原种质资源数量的增加而减小。刘娟等构建的新疆野杏核心种质，其原种质135份，核心种质33份，取样比例为25%。张欢等利用叶表型性状对161份水青树构建核心种质，认为45%的取样比例是较为合适。李洪果等分别对306份杜仲雄株和396份杜仲雌株构建了核心种质，认为10.8%和11.6%分别是雄株和雌株的最佳取样比例。本研究供试西伯利亚杏201份，发现15%的取样比例虽具有最大的各项参数，但表现型丢失较多，而20%的取样比例构建核心种质各项参数仅次于15%，但明显高于其余比例，因此，20%是西伯利亚杏核心种质的最佳取样比例。

在表型核心种质构建过程中，不分组整体取样是常用策略之一。侯志强等发现不分组整体取样构建的菊芋核心种质的代表性大于根据地理来源分组构建效果，该构建方式也在杜仲、毛花猕猴桃、美洲黑杨等林木上取得较好的效果。也有学者将原种质依地理来源，植物学分类体系或生态类型等信息分组，在各组内抽取材料后，汇集在一起组成核心种质，目的是为了保证取样的代表性和反映不同条件下的遗传多样性差异。余萍等在构建野生稻核心种质过程发现分组优于不分组，本研究得到与之相反的结果，原因可能是西伯利亚杏存在不同地区相互引种及基因流动的现象，而这些现象会导致西伯利亚杏地理多样性和遗传多样性的关系逐渐模糊，材料间地理起源的差异不再能反映其在遗传及形态上的差异。本研究中的201份西伯利亚杏种质多处于野生半野生状态，多数来自河北北部、辽西地区、内蒙古东南和东部等地区，这几个地区地理距离均较近，存在相互引种及基因交流的现象。

主成分分析可以近似的描述样品在几何空间的分布特征，并反映供试材料的遗传结构，可以用来比较核心种质和原种质的分布特征。本研究通过比较最优核心种质和原种质的主成分分布图，结果表明两者分布特征非常相似，原种质外围的几个种质被选中，表明最优核心种质的建立在一定程度上去除了原种质中的遗传冗余，进一步确认了在20%的取样比例下，采用欧式距离和类平均法结合优先取样法是构建西伯利亚杏核心种质的最佳构建策略。

本研究利用西伯利亚杏枝、叶、果实、果核、果仁等性状构建了表型核心种质。本研究中核心种质经过补充优化后共44份种质，包含原种质所有的性状极值，各种源均有所分布，具有代表性、多样性和异质性。尽管核心种质能够最大程度的代表原种质的遗传多样性，但仍需要保留其余种质，以便育种专家在保留种质中找到未包含于核心种质的性状。动态性是核心种质的重要属性之一，根据研究条件或目的，合理调整核心种质库的材料构成，使之与保留种质之间存在一定程度的交流。此外，核心种质库的大小和内容也应随时间而变化。本研究供试的201份西伯利亚杏的种源涉及2个国家的14个种源，但部分地区收集资源较少，因此，需不断补充新的西伯利亚杏种质资源，以保证该物种多样性和资源的长期利用。

在综合利用数量性状和质量性状数据构建西伯利亚杏核心种质的过程中，优先取样法优于偏离度取样法和随机取样法，欧式距离优于马氏距离，最长距离法优于UPGMA、WPGMA、可变类平均法、离差平方和法和最短距离法，20%是最适宜的取样比例。采用优先取样法，根据欧式距离结合最长距离法进行逐步聚类，是构建西伯利亚杏核心种质最佳策略，构建的核心种质经过补充优化共44份核心种质，能够代表原种质的遗传多样性。