硫酸锌对苹果叶片光合产物的合成及其向果实运输的影响
2022-04-19秦嗣军吕德国
于 波，秦嗣军，吕德国
（沈阳农业大学园艺学院,沈阳 110161）
现阶段我国苹果种植面积和产量均占全球50%以上，已经成为世界上最大的苹果生产国。随着我国社会经济的发展与人民生活水平的提高，广大消费者对苹果果实品质提出了更高的要求，但时下产量过剩和品质差仍是我国苹果产业的生产现状。如何提升果实品质以满足消费者对高品质苹果的需求，提高苹果产业的经济效益已成为当前苹果产业亟待解决的问题。可溶性糖含量是果实品质的重要指标之一，果实内糖的积累水平首先取决于苹果叶片光合产物的合成及其向果实的输入，因此增强叶片光合产物合成能力，促进叶片光合产物向果实的转运是提升果实品质的重要途径。
外源施用硫酸锌可通过调控马铃薯块茎中蔗糖与淀粉代谢关键酶活性，促进了块茎中淀粉的合成与积累。甘万祥等研究表明，夏玉米灌浆期籽粒可溶性糖含量受硫酸锌施用浓度影响显著，表现为籽粒中可溶性糖含量随着硫酸锌浓度的提高先升后降。当前在苹果生产中，通过叶面喷肥来提升果实可溶性糖含量的果园管理措施已屡见不鲜，但有关其对果实可溶性糖含量提升的内在生理机制仍需深入研究。相关研究虽表明，外源喷施硫酸锌可通过影响糖代谢相关酶活性来调控苹果发育过程中糖的代谢，进而影响果实内可溶性糖含量，然而果实中可溶性糖含量主要取决于叶片光合同化物向果实的运输，叶片光合同化物的合成及其向果实的运输是果实糖分积累的重要前提。但目前为止，有关叶面喷施硫酸锌对苹果果实发育过程中叶片光合产物的合成及其向果实运输的影响的研究尚未见报道。苹果果实膨大期是果实生长发育过程中对叶片光合产物需求最旺盛的时期，加强该时期叶片光合同化物的合成及向果实的运输，既满足此时期果实发育对光合同化物的需求，同时也为果实中糖的积累、成熟期果实品质的提升提供了保证。基于此，本研究在已有的光合作用及果实糖代谢影响的研究基础上，以自然生草制苹果园8年生寒富/GM256/山定子为试材，充分考虑苹果枝条与叶片类型复杂所带来的光合能力和养分输送能力的差异，依据果树光合产物优先供应生长中心、由源到库和就近供应的特性，利用C同位素标记技术和生理生化分析手段，以叶片涂抹不同浓度硫酸锌溶液的方式，研究硫酸锌浓度与叶片光合同化物合成以及果实糖代谢相关酶活性的关系，对揭示硫酸锌调控叶片同化物的合成以及果实糖分积累的生理机制具有重要意义，可为苹果果实发育关键时期通过叶面追肥措施提高果实品质奠定理论基础。
1材料与方法
1.1 材料
试验于2019年在沈阳农业大学寒富苹果现代栽培制度长期定位试验园进行，试验区海拔76.2m，年日照时数2372h，无霜期146~163d，年平均降水量721mm。该苹果园全园实行行间自然生草，行内清耕。本试验选取8a生寒富/GM256/山定子为试材，南北行向，株行距为2.0m×4.0m。供试硫酸锌（ZnSO·HO，AR）为国药集团化学试剂有限公司生产；BaCO（C丰度98%）为上海化工研究院有限公司生产；Rubisco酶活性检测GMS16015.1试剂盒为上海杰美基因医药科技有限公司生产。
1.2 方法
试验处理开始于2019年8月20日，共选取30个生长一致、外围多年生结果枝，每个处理均为6个结果枝，其中3个结果枝用于C脉冲标记，另外3个结果枝不进行标记。为降低苹果枝条与叶片类型复杂所带来的果实内光合同化物来源的差异，本试验在处理开始前按照叶果比40∶1进行疏果与摘叶，建立“源库单位”。每个结果枝“源库单位”的数量保持一致。试验共设置5个不同ZnSO·HO浓度梯度处理，CK（0）、ZS1（0.1%）、ZS2（0.2%）、ZS3（0.3%）和ZS4（0.4%），对照（CK）为清水涂抹。于8月20日15∶00用毛笔均匀涂抹整个结果枝叶片的正反两面，每枝结果枝用量均为100mL。8月26日（处理5d后）按上述同样方法再涂抹1次。处理10d后进行C脉冲标记。
处理10d后（9月1日）的8∶00各处理开始进行C标记。用农用透明塑料薄膜（透光率为95%）做成的标记室将整个结果枝包裹住并检查标记室的密封性，同时为避免标记的结果枝C光合产物向树体其他部位运输，在开始标记前先将整个结果枝基部进行环剥，对伤口包扎密封，而后用注射器向标记室内装有2g BaCO的离心管中加入一定量的1mol·LHCl溶液。此后每隔30min向离心管内加入一次盐酸（盐酸需过量，保证BaCO完全反应），以维持标记室内CO浓度。整个标记过程持续4h。同时另选远距离未受C污染的3株作为空白对照。C脉冲标记完成后分别于24，48，72h，每个C标记的结果枝选取3个果实进行C测定。另外15个未标记的结果枝于9月4日取样，进行相关指标测定。
1.3 测定项目与方法
1.3.1 叶片叶绿素荧光参数测定 于9月4日(晴天)各处理在结果枝（未进行C标记）均匀选取20片叶片，进行15min的叶片暗处理后，用FMS-2便携脉冲调制式荧光仪（Hansatech,英国）测定叶绿素荧光参数。
1.3.2 叶片叶绿素含量、Rubisco酶活性以及光合参数测定 于9月4日9∶00~11∶30(晴天)各处理在每个结果枝(未进行C标记)均匀选取20片叶片，用CIRAS-2光合仪测定叶片净光合速率（P
）。而后将叶片带回，采用乙醇浸提法测定叶绿素含量，Rubisco酶活性采用GMS16015.1试剂盒进行测定。1.3.3 叶片山梨醇、蔗糖含量及6-磷酸山梨醇脱氢酶（S6PDH）和蔗糖磷酸合酶（SPS）活性测定 9月4日，各处理均匀选取被涂抹的部分叶片剪碎,用锡箔纸包好后，放入液氮中，带回实验室进行相关指标测定。山梨醇和蔗糖含量用高效液相色谱仪测定，S6PDH和SPS的活性测定参考YAMAKI的方法。
1.3.4 果实糖代谢酶活性测定 各处理于9月4日选取结果枝（未进行C标记）苹果果实样品（各处理均均取3个）。参考高俊凤的方法制备酶液。而后参考RUFLY等的方法测定山梨醇脱氢酶（SDH）活性；参考YA⁃MAKI的方法测定山梨醇氧化酶（SOX）活性；根据HUBER的方法测定蔗糖合酶分解方向活性（SS-c）；参考MERLO等方法测定酸性转化酶（AI）和中性转化酶（NI）的活性。
1.3.5 果实C丰度测定 果实δC采用同位素比率质谱仪（DELTAVXP）在中国林业科学院稳定同位素实验室测定。测定前，先将果实进行清洗（先用清水、洗涤剂、清水、1%盐酸进行清洗后，然后用去离子水进行3次冲洗）、杀青（105℃下0.5h）和烘干（70℃下烘干至恒量），而后用电动磨样机磨碎并过60目筛，混匀装袋。
各器官C丰度的计算公式为：
R
碳同位素的标准比值）=0.0112372。各器官所含的碳量计算公式为：
各器官C质量计算公式为：
C
为各器官所含的碳量(g)；nl
表示未标记。
α
=0.05。2结果与分析
2.1 硫酸锌处理对苹果叶片叶绿素荧光参数和光合性能的影响
与CK处理相比，ZS1、ZS2、ZS3和ZS4处理均不同程度地提高了叶片F
/F
、Φ
、q
与ETR，且提升效果均以ZS3处理最好，分别为CK处理的1.04，1.11，1.36和1.22倍（表1）。进一步分析可以发现，随着叶片硫酸锌涂抹浓度的增加，叶片Rubisco酶活性、叶绿素含量和净光合速率（P
）均表现为升高后降低，且均在ZS3处理下达到最大值，其值分别较CK提升17.09%、31.21%和30.16%。可见，叶片涂抹适宜浓度硫酸锌明显提高了叶片的光合能力，同时提高了光合电子传递和光化学速率，使叶片吸收的光能充分地用于光合作用，从而加速了CO同化，促进了叶片光合产物的形成。表1 硫酸锌处理对苹果叶片叶绿素荧光参数和光合性能的影响
Table 1 Effects of different ZnSO·H O levels on chlorophyll fluorescence parameters and photosynthetic characteristic of leaves
同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著(<0.05)。下同。
Different small lettersin thesame column meant significant differenceamongtreatments at 0.05 level.Thesamebelow.
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2.2 硫酸锌处理对苹果叶片碳代谢的影响
涂抹硫酸锌处理后，叶片山梨醇和蔗糖含量分别较CK处理提高23.58%~55.24%和13.33%~25.00%，S6PDH和SPS酶活性分别较CK处理提高12.10%~48.12%和17.32%~49.92%（表2）。ZS3处理山梨醇和蔗糖含量提升效果最好，S6PDH和SPS酶活性最高，山梨醇和蔗糖含量分别是CK处理的1.55和1.25倍，S6PDH和SPS活性分别是CK处理的1.48和1.50倍。叶片涂抹硫酸锌处理提高了叶片光合同化物的合成能力，有利于同化物向外输出。
表2 硫酸锌对苹果叶片碳代谢的影响
Table 2 Effects of different ZnSO·H O levels on carbon metabolism of leaves
?
2.3 硫酸锌处理对苹果果实糖代谢酶的影响
苹果果实糖分积累水平与其内部糖代谢酶活性密切相关。表3反映了不同处理对果实糖代谢酶的影响。由表3可知，山梨醇脱氢酶（SDH）与酸性转化酶（AI）活性受不同锌浓度影响显著，随着硫酸锌涂抹浓度的增高都有一个先增高后降低的过程，且均在ZS3处理下达到最大值，其值分别较CK处理提升34.64%和19.35%。与CK处理相比，叶片涂抹锌处理对山梨醇氧化酶（SOX）、蔗糖合酶分解方向（SS-c）以及中性转化酶活性的调控均无显著影响。可见，硫酸锌通过调控特定糖代谢相关酶活性，进而调控果实糖代谢过程，从而影响了山梨醇和蔗糖向单糖的转化。
表3 硫酸锌处理对苹果果实糖代谢酶的影响
Table 3 Effects of different ZnSO·H O levels on enzyme activity of fruit sugar metabolism (μmol·h·gFW)
?
2.4 硫酸锌处理对苹果叶片13C光合产物向果实运输速率和果实13C含量的影响
由表4可知，随着处理时间的增加，各处理果实C含量均逐渐增加。同一取样时间下，当硫酸锌浓度为0~0.3%时，随着硫酸锌浓度的提高，果实C含量均表现为逐渐升高，均在ZS3处理下达到最高，其值分别为0.50mg·g（24h）、0.61mg·g（48h）和0.68mg·g（72h）；当锌浓度为0.3%~0.4%时，果实C含量逐渐减少。由此表明，涂抹0.3%的ZnSO·HO溶液处理促进了叶片中光合产物向果实的运输，为果实中糖的积累提供了充足的碳源保障。
表4 硫酸锌处理对苹果叶片C光合产物向果实运输速率和果实C含量的影响
Table 4 Effects of different ZnSO·H O levels on transport rate of C from leaf to fruit and C content of apple fruit
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通过对叶片C光合产物向果实运输速率分析可知，各处理C光合产物运输速率均表现为24h最高；48h次之；72h最低，表明光合产物从叶片向果实的运输主要集中在C标记后24h内。同一取样时间下，C光合产物向果实运输速率均以ZS3处理最高。由此表明，叶片涂抹适宜浓度硫酸锌提高了光合产物向果实的转运效率。
2.5 苹果果实13C吸收量与果实糖代谢酶活性的相关性分析
山梨醇和蔗糖代谢相关酶活负责调控苹果果实库强，与光合产物向果实输入有较好的相关关系。对果实C吸收量与果实糖代谢相关酶活性进行相关性分析结果（表6）表明，果实C吸收量与SOX、SS-c以及NI不存在相关性，与SDH和AI呈极显著正相关。
表6 苹果果实C吸收量与果实糖代谢酶活性的相关性分析
Table 6 Effects of different treatments on transport rate of C from leaf to fruit and C content of apple fruit
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3 讨论与结论
光合作用是果实生长发育的基础。本试验结果表明，叶片涂抹适宜浓度硫酸锌处理可提高叶片光合性能，提高同化物合成能力，为果实的生长发育以及果实内糖分的积累提供了充足的物质保障。植物叶片光能吸收的分配去向可由叶绿素荧光动力学参数准确反映。本研究结果表明，叶片涂抹适宜浓度硫酸锌显著提高了苹果叶片F
/F
、Φ
、q
以及ETR。一方面，适宜硫酸锌浓度处理通过增强光合作用来增强叶片碳同化过程；另一方面，叶面涂抹适宜硫酸锌浓度提高了PSII反应中心的功能，叶片大部分反应中心保持开放状态，扩大了光能向碳同化转移的比例。叶片光合碳同化速率与其光合强度两者紧密联系。本研究发现，植株叶片光合特性受硫酸锌调控影响显著。叶片涂抹适宜浓度硫酸锌处理提高了叶片内叶绿素含量，提高了叶片净光合速率与气孔导度，提高了光合碳同化过程中的CO利用效率；此外，适宜硫酸锌浓度处理通过提高叶片Rubisco酶活性，进一步增强了叶片光合作用，提高同化物合成能力。苹果作为多年生蔷薇科木本植物，苹果叶片碳同化物主要是山梨醇（约占总量的80%）和蔗糖（约占20%）。本试验通过对叶片山梨醇和蔗糖含量及其相关合成酶活性的测定发现，硫酸锌处理对叶片碳同化能力影响显著，其中以ZS3处理下叶片碳同化能力最高。叶片较多的碳同化产物（山梨醇和蔗糖）有利于扩大源库间的压力势差，促进同化物向外输出。ALBACETE等研究表明，提高果实库强，进而提高果实对光合产物的竞争力，促进光合产物从叶片向果实的运输，是果实品质提升的关键。相关研究表明果实中山梨醇、蔗糖代谢相关的酶活性是衡量果实库强的重要指标。本研究通过测定果实糖代谢相关酶活性发现，山梨醇脱氢酶（SDH）与酸性转化酶（AI）受硫酸锌浓度处理影响显著，均表现为随着硫酸锌浓度的增加先增高后降低，均在ZS3处理下达到最大值。这表明在果实膨大期，硫酸锌通过调控果实中山梨醇脱氢酶（SDH）与酸性转化酶（AI）酶活性来调控果实中山梨醇代谢与蔗糖代谢，这与张勇等研究结论一致。一方面果实中糖代谢相关酶活性增强，促进了山梨醇和蔗糖的转化，使得液泡中己糖含量增加，液泡渗透势下降，进而促使细胞外水分进入细胞，由此进一步增加了果实与韧皮部山梨醇和蔗糖的浓度差，为其向果实卸载提供了动力；另一方面叶面涂抹硫酸锌提高了果实内锌含量，而锌在赤霉素（GA）与吲哚乙酸（IAA）的合成过程中扮演着重要角色。GA可以显著提高果实库力，而IAA可以显著激活山梨醇脱氢酶（SDH）活性，还可以提高山梨醇主动进入库细胞的能力，因此硫酸锌还可能通过提高果实中IAA与GA来调控果实糖代谢。除此之外，山梨醇、蔗糖代谢相关的酶活性与果实同化物的卸载能力密切相关，糖代谢相关酶活性越高，果实中卸载糖的能力越强。本研究中外源硫酸锌通过提高果实糖代谢酶活性，提高了糖在果实中的卸载能力，为果实中糖的代谢以及果实成熟期可溶性糖的积累提供了物质基础。与此同时，本研究结果还表明，不同浓度硫酸锌处理对山梨醇氧化酶（SOX）、蔗糖合酶分解方向（SS-c）以及中性转化酶均无显著影响。这可能是因为山梨醇氧化酶（SOX）在果实膨大期酶活性较低且80%以上为束缚型，而在果实膨大期，果实生长发育对UDPG的需求减少，因而硫酸锌处理对SS-c作用效果不显著。
叶片光合同化物向果实中运输与苹果果实糖分的积累密不可分。本研究结合C同位素示踪技术发现，相较于对照处理，叶片涂抹不同浓度硫酸锌溶液处理均显著影响了叶片光合同化物向果实的运输，提高了果实对光合产物的竞争能力，表现为果实C含量增加。通过对不同时间段果实取样分析可知，发现适宜浓度硫酸锌（0.3%ZnSO·HO）处理加快了光合产物由叶向果的运输速率，提高了光合产物进入果实的效率。出现这一结果的原因可能与果实库强有关。结合相关性分析进一步分析表明，果实C积累量与SDH与AI呈极显著正相关，这可能是由于在果实膨大期，SDH与AI酶活性可以较好反映果实库强。
叶片涂抹适宜浓度硫酸锌一方面提高了源叶活力，“推动”了同化物的由叶片向果实运输，另一方面提高了果实库强，使得果实对同化物的需求增加，“拉动”了同化物向果实的运输。在本试验中，果实膨大期对苹果结果枝叶片涂抹0.3%ZnSO·HO溶液，显著增强了叶片同化物制造能力，促进了叶片同化物向果实的输送，对于成熟期果实可溶性糖含量的提高是一项可行的技术。
