心肌梗死后心力衰竭大鼠外周血细胞基因组学特征

杜洋，赵晓燕

（郑州大学第一附属医院心血管内科，河南 郑州 450052）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是一种严重的急性缺血性心脏状态［1］，供养心肌的冠脉血管由于各种原因急性闭塞，导致部分心肌血液供应突然中断，心肌因无法获取足够的能量而导致急性损伤以及一系列的后续并发症。近年来随着各种新药、新技术的应用，特别是各地胸痛中心的广泛建立，MI后得到血管再灌注治疗的时间明显缩短，MI的病死率明显下降，但同时MI后心力衰竭（heart failure，HF）以及HF导致的心源性休克的发生率明显提高，它的发生不仅增加了MI的治疗难度，而且恶化了MI预后。目前针对HF的治疗仍然以药物为主，主要针对神经体液因素、心肌能量代谢、心室重构以及改善临床症状等。但现有药物在临床治疗过程中仍有许多不足。基因组学的目的是对生物体所有基因进行集体表征、定量研究及不同基因组比较研究，在表征和量化后研究基因组的结构、功能、进化、定位和编辑等，以及其对生物体的影响［2］。通过基因测序、遗传分析等手段，对基因组间和组内的相互作用进行研究。本研究采用生物信息学分析工具对MI后HF大鼠的外周血单个核细胞基因组学特征进行分析，为揭示MI后HF的基因组学特征、阐明MI后HF形成过程、寻找药物治疗新靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1 获取基因数据在GEO DATESETS数据库中（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／gds）搜索“heart failure”的标本，选择“大鼠（rattus norvegicus）”作为研究物种，挑选DOROTA TULACZ等提交的名为GSE47495基因芯片数据，这是一组来自Affymetrix Mouse Gene 1.0 ST Array基因表达芯片平台GPL6247，共有29 214个基因的芯片数据。选择ID 为GSM1151177～GSM1151182的6个样本作为假手术组（Sham组）、ID为GSM1151183～GSM1151187的5个左冠状动脉结扎诱导的MI后HF样本作为HF组。

1.2 差异基因分析筛选差异基因使用官方GEO2R分析工具［3］（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／geo／geo2r），其中Sham组为对照组。分别获取差异有统计学意义（P＜0.05）的表达上调（LogFC＞0）和表达下调（LogFC＜0）的差异基因，然后选择其中表达差异最大的基因各50个（共计100个基因）进入下一步分析。

1.3 功能和信号通路富集分析使用DAVID 6.8在线数据库（https：／／david.ncifcrf.gov／summary.jsp），将获取的100个差异基因分别导入，进行GO功能富集分析及KEGG Pathway富集分析。再通过STRING 11.0数据库（https：／／string-db.org／）验证DAVID网站的GO功能富集分析结果，通过Webgestalt数据库（http：／／www.webgestalt.org／）验证DAVID网站KEGG Pathway分析结果［4］。

1.4 蛋白相互作用分析将差异基因导入STRING 11.0数据库（https：／／string-db.org／）进行差异基因相关蛋白的蛋白相互作用分析［5-6］，做出蛋白相互作用网络图。

1.5 核心基因分析为了进一步研究哪些基因在大鼠MI后HF的发展过程中发挥核心作用，将方法1.4中获得的差异基因和蛋白相互作用结果导入到Cytoscape 3.7.2（https：／／cytoscape.org／）可视化分子相互作用网络分析软件中，使用MCODE插件获取核心基因［7］。

2 结果

2.1 差异基因筛选Sham组与HF组大鼠芯片数据分布良好。见图1。与Sham组相比，HF组大鼠外周血样本中共有475个基因表达差异有统计学意义（P＜0.05），其中表达上调259个，表达下调216个。在其中筛选出上调、下调最显著的基因各50个，共计100个基因进一步分析。见表1。

表1 100个明显变化的基因

图1 Sham组和HF组大鼠芯片数据箱图

2.2 GO功能富集分析DAVID数据库GO功能富集分析结果显示，上调基因富集在细胞膜、内膜系统、细胞核等多个细胞成分中，具有参与蛋白分子的结合、调控转运体活性等功能，涉及细胞增殖调控、细胞代谢、细胞分化等多个生物过程。而下调基因则富集在细胞膜等成分中，具有参与蛋白质结合等功能，涉及B细胞活化、适应性免疫反应、凝血调节等多个生物过程。见表2、3。

表2 上调差异基因GO功能富集分析

表2（续）

细胞组分（cellular component，GO-CC）用于描述基因产物在细胞中的位置；分子功能（molecular function，GO-MF）大部分指的是单个基因产物的功能，如结合活性或催化活性等；生物学途径／过程（biological process，GO-BP）多是指具有多个步骤的有序的生物过程。

表3 下调差异基因GO功能富集分析

2.3 KEGG Pathway富集分析差异基因主要参与了免疫信号通路、细胞自噬等细胞信号转导过程。见表4。

表4 100个差异基因KEGG通路分析

2.4 差异基因蛋白相互作用分析STRING数据库分析结果显示，免疫过程相关分子（KLRC1、KLRC2、KLRD1等）、趋化因子家族（CCR6、CXCR6等）、G蛋白偶联受体（GPR183等）、凝集素家族（CD209A、CD209BCLEC4M等）、调节细胞周期、遗传物质修复（PTTG1、CDKN3、TOP2A等）多个分子在相互作用网络中处于关键节点。见图2。

图2 差异基因蛋白相互作用网络图

2.5 核心基因分析采用Cytoscape的MCODE插件分析，结果显示KLRC1、KLRC2、KLRD1等与免疫过程相关的分子在大鼠MI后HF的发生发展过程中发挥了核心作用。见图3，表5。

图3 大鼠MI后HF过程中的关键分子

表5 大鼠MI后HF过程中的关键分子

3 讨论

在临床实践过程中，因MI而住院患者的HF发生率在14%～36%之间，不同研究数据稍有差异［8］。在对1994—2008年包括46 519名非ST段抬高型MI患者在内的7项随机临床试验进行综合分析后发现，与非HF患者相比，入院时或住院期间出现HF患者的30 d病死率分别增加1.74倍和2.34倍［9］。HF既可以发生在入院时，也可能发生在住院期间，造成病死率上升，医疗负担加重。而HF导致的虚弱状态，同时增加了家庭照顾、社会保障等成本［10］。MI后HF的治疗主要有两方面，一方面通过β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂以及醛固酮拮抗剂等药物控制神经体液反应，改善心脏负荷，另一方面通过机械循环辅助等方式帮助危重症病例渡过心功能严重不足时期，但最为重要的是早期完成血管再灌注治疗，这是唯一被证实可以降低MI后HF、心源性休克病死率的方式［8］。在既往研究者不断的努力下，HF的发生发展机制越来越清晰［11］，神经内分泌平衡打破、心室重构［12-13］、能量代谢紊乱、炎症反应［14］等多重因素可能共同导致了MI后HF的发生发展。近来的研究表明，免疫炎症因素可能是MI后HF的重要原因，包括最初的促炎反应，然后是抗炎阶段。这两个阶段之间的过渡至关重要，持续和严重的促炎反应导致左心室不良重塑和HF倾向明显增加［15］。因此调节免疫细胞对急性MI的反应可能是改善急性MI患者临床结果的潜在策略［16］，但既往抗炎心脏保护疗法失败率高，需要研究新的疗法来减少MI的大小，并预防急性MI患者HF的发作。

随着分子生物学研究的进步，对于MI后HF的机制研究也扩展到了基因组学层面。本研究采用生物信息学工具分析MI后HF大鼠外周血单个核细胞基因组学特征，为揭示MI后HF的基因组学特征、阐明MI后HF的形成过程、寻找药物治疗新靶点提供依据。本研究结果显示，大鼠HF组和假手术组的100个差异基因主要富集在细胞膜、细胞内膜系统、细胞核、细胞外空间等成分中，它们的分子功能有调控蛋白质结合、转运蛋白活性等，涉及的生物过程包括细胞应激、免疫、通信、代谢、凋亡等［17］。KEGG Pathway富集分析结果显示，100个差异基因主要参与了免疫信号通路、细胞自噬等细胞信号转导过程。其中免疫过程相关分子（KLRC1、KLRC2、KLRD1等）、趋化因子家族（CCR6、CXCR6等）、调节细胞周期、遗传物质修复（PTTG1、CDKN3、TOP2A等）多个分子在相互作用网络中处于关键节点。KLRC1、KLRC2、KLRD1等与免疫过程相关的分子在大鼠MI后HF的发生发展过程中发挥了核心作用。

本研究存在以下不足：（1）本研究的基因芯片数据来源于大鼠模型，与人体基因可能存在无法预知的物种间差异，最终的临床治疗决策仍然需要符合医学伦理的基于人体基因数据的进一步研究结果的支持；（2）生物信息学工具种类繁多，发展迅猛，迭代频繁，虽能帮助预测潜在关键分子与通路，缩小研究范围，提高研究效率，但最终研究结果仍然有赖于真实的基因数据在基础和临床中的验证结果；（3）进行功能和信号通路富集分析采用的数据库虽然是经典的数据库，数据全面完整，但是其更新缓慢，未纳入较新的研究成果，这可能对结果产生一些无法预知的影响。

综上所述，MI后HF的发生发展是一个复杂的、动态的、综合性过程，细胞应激、免疫、通信、代谢、凋亡等生物过程、细胞免疫信号通路、细胞自噬的启动参与其中，而免疫过程又在其中处于核心地位，其中KLRC1、KLRC2、KLRD1等与免疫过程相关的分子在大鼠MI后HF的发生发展过程中发挥了核心作用。这可能为今后寻找药物治疗新靶点提供依据。