SEZ6L2基因单核苷酸多态性与199例食管癌患者术后生存期关联分析

马琳琳，赵学科，宋 昕，徐瑞华，魏梦霞，李留玉,，尤 朵,3，王 苒，韩雪娜，孙 琳,，陈亚杰,，乔佳欣，谢叶真，白合林，王立东

食管癌是全球最常见的六大恶性肿瘤之一，有极高的发病率和死亡率[1-2]。每年全球新发食管癌患者约50万例，其中发生在中国的占2/3[3-4]。中国食管癌突出的流行病学特点是显著的地域性分布和明显的家族聚集性，从而形成明显的食管癌高低发区[5]。河南、山西和河北交界的太行山地区，是中国，也是全球食管癌发病率和死亡率最高的地区，特别是河南林州[6-8]。中国97%以上的食管癌为食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)[9]，食管癌的发生、发展是遗传和环境因素交互作用的结果[10]。以往绝大多数报道关于食管癌的发生是由各种外在因素引起的，而内在因素，比如基因突变在肿瘤发展的过程中同样起到非常重要的作用。此外，从遗传流行病学得出，涉及癌变过程中不同的基因多态性也可能会使个体对食管癌的易感性发生改变，这种多态性也对癌症的预防和治疗起到了非常关键的作用[11]。

β-半乳糖苷酶(Beta-galactosidase，GAL)是一种溶酶体外糖苷酶，通过释放β连接的末端半乳糖残基参与糖共轭物的分解代谢。当酒精和尼古丁依赖性与结肠癌重合，高活性的β-半乳糖苷酶可能加速了癌症的生长、侵袭、转移和成熟[12]。β-半乳糖苷酶在GH分泌和NFPA中有明显的高表达，在癌组织中也有显著的高表达。作者推测，这可能是肿瘤恶性进展罕见的原因[13]。同时也有大量研究表明β-半乳糖苷酶1(GLB1)参与肿瘤的发生发展和细胞衰老[14]。因此，本课题研究SEZ6L2 rs7533174单核苷酸多态性和GLB1之间的关联，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象的采集

纳入的199例患者均来自于郑州大学第一附属医院省部共建食管癌防治国家重点实验室中的50万例食管癌患者临床信息数据库[15-16]。患者均来自于河南省食管癌高发区的某市级医院，经医院确诊并进行手术治疗，确诊时间为2019年11月至2020年1月。其中男132例(66.33%)，女67例(33.67%)，每位患者均签了知情同意书，并经郑州大学伦理委员会批准。收集199例ESCC患者的癌组织和癌旁组织，均为手术切除后30 min内的新鲜组织样本，并进行宏观解剖，然后保存在-80 ℃冰箱。样本采集前没有接受放化疗等抗肺瘤治疗，然后以半定量的方式对肿瘤细胞进行视觉评分，仅选择其中恶性细胞>70%的肿瘤细胞进行全基因组外显子测序。癌旁正常组织是从距肿瘤边缘至少2 cm远的邻近上皮正常组织(对照)，用于取样和分子分析。

本研究主要通过电话、到家随访、乡村医生与患者或患者家属直接联系，以及新合作医疗数据库、医疗保障局数据库和公民死亡信息登记管理等系统查询方式进行随访，每半年进行一次随访，记录健在或去世以及去世时间和主要死因等。

1.2 组织样本的制备

将199例ESCC患者的癌组织和癌旁组织配对，分装到提前准备好的已经标记的冻存管内，样本编号为001～199号，ESCC组织用字母T标记(Tumor)，癌旁正常组织用字母N标记(Normal)。收集到的样品在液氮中快速冷冻并保存，同时要保证每份样品有足够的DNA可供提取，然后用CTAB法提取DNA。

1.3 多组学SNP位点捕获、检测与筛选

1.3.1 DNA样品检测利用琼脂糖凝胶电泳来分析DNA样本是否含有蛋白、RNA污染及其降解程度。如果DNA出现降解，对应的条带就会变暗或者消失。并用Qubit 3.0测出DNA样本浓度，选择0.6 μg以上的样品进行后续建库。

1.3.2 建库捕获及上机测序采用Agilent液相芯片捕获系统对人全外显子区的DNA进行富集，Agilent SureSelect Human All Exon V6试剂盒进行建库及捕获，后在Illumina平台上进行高通量测序。

1.3.3 数据质量控制高通量测序获得的原始图像数据经过转化后形成原始Raw Data测序序列。将原始Raw Data数据进行过滤，并且控制平均碱基位置测序错误率低于0.1%，样本的测序reads达到95%以上的对比率，且碱基覆盖深度达到10×以上时，该点检测的SNP相对比较可信。

1.3.4 多组学SNP位点筛选实验方法为全基因组外显子测序WES(whole exome sequencing)(WES测序由诺禾致源测序公司进行)，基于WES数据中所检测到的SNP位点，经过将正常与癌组织中都有的SNP进行比对，共有62万个SNP；其中以编码区非同义突变、P<0.2为条件筛选出的SNP位点有3 897个；在GT和Mutation表中都存在且生存曲线有差异的有797个位点。rs75331747 SNP在患者的癌组织和癌旁组织中是一致的。

1.4 蛋白表达的测定

采用液相色谱—质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)技术对199例ESCC患者的癌组织和癌旁组织样本进行分析。

2 结果

2.1 SEZ6L2基因SNP rs75331747与ESCC生存与预后的关联性分析

199例ESCC患者中，有136例G/G基因型个体，51例G/T基因型个体，12例T/T基因型个体；T/T基因型个体的生存率显著高于G/G基因型个体，T/T基因型个体的生存率高于G/T基因型个体，G/T基因型个体的生存率高于G/G基因型个体(P<0.001)。见图1。

图1 3种基因型术后生存分析比较

2.2 SEZ6L2 rs75331747基因型与GLB1蛋白表达之间的关系

eQTL分析发现，eQTL距离调控基因非常远，大于20 Mb以上，可能通过调控SEZ6L2基因产生的转录调控蛋白来介导靶基因的表达。作者做了rs75331747与GLB1蛋白表达量关系的研究。相对于rs75331747的参考型GG，突变型TT型蛋白表达量最少，rs75331747突变后，通过调控SEZ6L2基因产生的转录子，显著降低GLB1的表达。见图2。

图2 rs75331747的3种基因型GLB1蛋白表达

3 讨论

研究发现，食管癌的发生和发展是基因—遗传—环境交互作用共同导致的结果[10]。本研究探讨SEZ6L2基因rs75331747(G>T)多态性与ESCC患者生存之间的关系。在单个核苷酸位点分析时，SEZ6L2基因rs75331747 SNP位点与ESCC患者生存有统计学意义上的关联。提示SEZ6L2基因SNP与ESCC患者生存结局有关系，可能成为预测ESCC患者生存的潜在预后标志物。

通过检查rs75331747遗传变异对GLB1表达的潜在调节作用，发现rs75331747 G等位基因是风险等位基因。在199例人食管组织标本的基因型—蛋白相关分析中，rs75331747 G/T或G/G与GLB1蛋白表达显著增加相关(P<0.001)。本研究数据表明，SEZ6L2 rs75331747 SNP与ESCC的易感性相关，GLB1可能参与ESCC发生。

SEZ6L1基因SNP rs75331747影响GLB1蛋白的表达，GLB1蛋白的表达与ESCC患者的生存预后相关。正常人SEZ6L1基因rs75331747的第713位碱基是G，当G基因突变后，GLB1蛋白的表达量减少，但预后变好。由此可见，SEZ6L2基因SNP rs75331747可能是致病SNP。

衰老是一种稳定的生长停滞，损害了受损、陈旧或癌前细胞的复制，因此有助于组织的稳态。衰老细胞在衰老过程中积累，与癌症、纤维化和许多与年龄相关的疾病有关。衰老细胞的一个普遍特征是溶酶体β-半乳糖苷酶的活性升高，这已被用作衰老的标志(衰老相关的β-氨基半乳糖苷酶活性)。GLB1增加与细胞不可逆生长停滞和衰老相关[17]。rs75331747通过影响β-半乳糖苷酶从而改变患者的生存期。

本研究样本量较少，在一定程度上影响了检验效能。因此，本研究结果需要更大样本量的研究来进一步验证。本研究发现携带rs75331747 T基因型的ESCC患者，其生存结局更好，而关于其影响机制，目前尚未完全阐明，需要进一步深入开展SNP功能学研究来解析其影响ESCC预后的分子机制[11]。

综上所述，SEZ6L2基因SNP rs75331747可能影响ESCC患者的生存结局，可以作为今后ESCC患者生存结局的潜在预后标志物。