HLLA1基因单核苷酸多态性与高发区食管鳞癌患者术后生存分析

谢叶真，赵学科，宋 昕，徐瑞华，魏梦霞，王 苒，韩雪娜，孙 琳,2，陈亚杰,2，马琳琳,2，乔佳欣,2，白合林，任景丽，周胜理，王立东

食管癌(esophageal cancer, EC)是世界多发恶性肿瘤之一，位居中国癌症死亡的第四位[1]。我国是世界食管癌高发国家之一，新增病例数位于世界前列[2]。近几年将早期检测、手术、放化疗等运用于食管癌的防治，取得了不错的成效，但食管癌的预后不良，5 a生存率仅有15%～25%[3]。在中国，97%的食管癌是食管鳞癌，具有显著高发区和家族聚集现象两大流行病学特征[4]。已有研究表明，食管癌可能是环境和遗传相互作用的结果[5]，其发生发展是由多种因素、多个阶段、多个过程决定的，环境是主导，通过基因起作用[6-7]。基因组变异是DNA的碱基对改变，包括胚系突变(单核苷酸多态性，即SNP)和体细胞突变[8-9]。目前，用全基因组测序(whole genome sequencing, WGS)和全基因组外显子测序(whole exome sequencing, WES)已发现了很多促进肿瘤发生发展的体细胞突变[10-11]，但食管癌多发生在亚种人群，而有关食管鳞癌胚系突变的研究很少，本次实验以199例高发区食管癌患者的癌组织细胞和癌旁组织细胞的全外显子测序数据，运用顺式表达数量性状基因座的分析方法，得到了与基因表达水平相关的SNP，将其中rs2280851 SNP的3个基因型与199例高发区食管癌患者术后总生存期进行生存分析，运用LC-MS/MS蛋白表达定量测得CTR9蛋白表达量，探究食管癌的可疑致病SNP。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

纳入的199例患者均来自郑州大学第一附属医院省部共建食管癌防治国家重点实验室50万例食管癌患者临床信息数据库[4]，患者均来自于河南省食管癌高发区的某市级医院，经医院确诊并行手术治疗，确诊时间为2019年11月至2020年1月。其中男132例(66.33%)，女67例(33.67%)，每位患者对本研究均知情同意，并且此项研究已获得郑州大学伦理委员会的批准。

收集199位食管癌患者的癌组织和癌旁组织，均为新鲜组织样本，在手术切除后30 min内进行宏观解剖，并保存在-80℃下。样本采集前未接受放化疗等其他治疗，以半定量的方式对肿瘤细胞进行视觉评分，仅选择恶性细胞>70%的肿瘤进行全基因组外显子测序。癌旁正常组织是距肿瘤边缘至少2 cm远的邻近上皮正常组织(生殖系对照)，用于取样和分子分析。本研究主要通过电话、家访、村医与患者或患者家属直接联系以及通过新合作医疗数据库、医疗保障局数据库和公民死亡信息登记管理等系统查询方式进行随访，每0.5 a进行一次随访，记录去世时间和主要死因等。本研究随访截止到2021年12月31日，随访成功199 例。

1.2 组织样本的制备

将199例食管癌患者的癌组织和癌旁组织配对，分装到准备好的已经标记的冻存管内，样本编号为001～199号，在样本类型中，食管癌组织用字母T标记(Tumor)，癌旁正常组织用字母N标记(Normal)。收集到的样品在液氮中快速冷冻并保存，同时保证每份样品有足够的DNA可供提取。

1.3 多组学SNP位点捕获、检测与筛选

1.3.1 DNA样品检测利用琼脂糖凝胶电泳分析DNA样本是否有蛋白，RNA污染及其降解程度。并用Qubit 3.0测出DNA样本浓度，选择0.6 μg以上的样品进行后续建库。

1.3.2 建库捕获及上机测序采用Agilent液相芯片捕获系统对人全外显子区的DNA进行富集，Agilent SureSelect Human All Exon V6试剂盒进行建库及捕获。后在Illumina平台上进行高通量测序。

1.3.3 数据质量控制高通量测序获得的原始图像数据经过转化后形成原始Raw Data测序序列。将原始Raw Data数据进行过滤，并且控制平均碱基位置测序错误率低于0.1%，样本的测序reads达到95%以上的对比率，且碱基覆盖深度达到10×以上时，该点检测的SNP比较可信。

1.3.4 多组学SNP位点筛选实验方法为WES(由诺禾致源测序公司进行)，基于WES数据中所检测到的SNP位点，经过将正常与癌组织中都有的SNP进行比对，共有62万个SNP；其中以编码区非同义突变、P<0.2为条件筛选出的SNP位点有3 897个；在Mutation表中都存在且生存曲线有差异的有797个位点。

1.4 蛋白表达的测定

采用液相色谱—质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)技术对199例食管癌的癌组织和癌旁组织样本进行分析。

2 结果

2.1 rs2280851 SNP与食管癌患者生存期的关联分析

rs2280851与生存期的生存分析曲线表明，rs2280851的A突变为G，199例食管癌患者中，有109例G/G基因型个体，54例A/G基因型个体，36例A/A基因型个体；A/A基因型个体生存率显著高于G/G基因型个体，A/A基因型个体生存率高于A/G基因型个体，A/G基因型个体生存率高于G/G基因型个体(P<0.001)。见图1。

图1 3种基因型术后生存分析比较

2.2 rs2280851与CTR9蛋白表达量的关系

eQTL分析表明，eQTL距离调控基因非常远，大于20 Mb以上，是通过调控HHLA1基因产生的转录子调控蛋白来介导靶标目的基因的表达。作者做了rs2280851与CTR9蛋白表达量关系的研究。相对于rs2280851的参考型A/A，突变型G/G型蛋白表达量最少，rs2280851突变后，通过调控HHLA1基因产生的转录子，显著降低CTR9的表达。见图2。

图2 rs2280851的3种基因型CTR9蛋白表达

3 讨论

食管癌是常见的消化道肿瘤之一，我国食管癌主要是鳞癌[12]，高发于河南、山西、太行山、闽粤等地区[13]。食管癌是环境和遗传长期相互作用的结果，有关研究已发现p53、BRCA2等基因与食管癌相关[14-15]，但是所用方法通量低，不能鉴别易感基因和变异位点。以高通量方法，系统地阐明食管癌相关候选基因非常必要。本实验对199例高发区食管鳞癌患者进行全外显子测序，通过样本检测、数据质控及与患者术后生存期进行生存分析，发现rs2280851位点突变型G/G对食管鳞癌患者的生存影响较大，为可疑致病SNP。通过NCBI数据库查找，rs2280851位点关联的基因为HLLA1。通过LC-MS/MS蛋白表达定量和eQTL相关分析，发现本组患者SNP rs2280851等位基因G的携带量与CTR9蛋白的表达呈负相关。

rs2280851 SNP影响HLLA1所调控的CTR9蛋白的表达，rs2280851 SNP与食管癌患者的生存预后相关。正常人与HLLA1基因相关的rs2280851的碱基是A，当A突变后，CTR9蛋白的表达量降低，但预后变差。由此可见，HLLA1基因SNP rs2280851G/G型可能是致病SNP。已有研究表明，CTR9是PAF1复合物重要的组成蛋白，PAF1在RNA聚合酶Ⅱ转录时起到辅助功能，参与染色质中组蛋白的甲基化修饰，在细胞内的转录延伸中发挥功能[16]。另外一个重要的蛋白是paf1，paf1和ctr9的突变会致癌或促进癌相关疾病的发展[17]。现有研究表明CTR9蛋白在肝癌患者的肿瘤组织中表达上调，CTR9的下调显著降低了肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移[18]。

目前普遍认为食管癌的发生机制是环境—基因—遗传相互作用，高发区是环境因素，高发区食管癌患者术后生存期低，可能与HLLA1基因的SNP rs2280851 A突变为G，CTR9蛋白表达降低有关。本研究运用全外显子测序技术和LC-MS/MS蛋白表达定量，首次提出SNPrs2280851对应的基因HLLA1的突变型GG是食管癌变的重要分子事件，提示HLLA1可能与肿瘤的发生和发展有关。同时为“环境-遗传-基因互作”食管癌变机制提供了新的证据和高危人群分子分型标记，有利于预警筛查早期发现和防治食管癌高危人群，确定用于早期发现、早期诊断和个体化的分子靶标，为进一步建立食管癌高危人群预警筛查、早期发现和防治提供理论和技术支撑。